1.लेमिनिन 521 की पृष्ठभूमि
लैमिनिन 521 (LN521) प्राकृतिक स्टेम सेल आला में एक प्रमुख सेल आसंजन प्रोटीन है और मानव भ्रूण (hES) और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (hiPSC) की संस्कृति और विस्तार के लिए एक मैट्रिक्स है। LN521 सेल सतह रिसेप्टर्स से जुड़ता है और सेल सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय करता है, जिसके परिणामस्वरूप अधिक कार्यात्मक कोशिकाओं का उत्पादन होता है।
लेमिनिन 521 इन विट्रो में जैविक रूप से प्रासंगिक hPSC वातावरण को पुन: पेश करता है, hPSC के जुड़ाव, उच्च अस्तित्व और मजबूत दीर्घकालिक स्व-नवीकरण को बढ़ावा देता है, और एक प्रमुख मैट्रिक्स प्रोटीन है जो स्टेम सेल विकास का समर्थन करता है और बेसमेंट झिल्ली संरचना और प्रदर्शन की स्थिरता को बनाए रखता है। लेमिनिन 521 भी सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले पोषक तत्व-मुक्त संस्कृति मैट्रिक्स में से एक है। इसके अलावा, लेमिनिन 521 किसी भी एपोप्टोसिस अवरोधकों को जोड़े बिना आनुवंशिक रूप से स्थिर और प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के कुशल एकल-कोशिका मार्ग को प्राप्त कर सकता है। कोशिकाएं किसी भी विभेदन क्षेत्र को मैन्युअल रूप से हटाने की आवश्यकता के बिना एक समान मोनोलेयर में बढ़ती हैं। इसके अलावा, अध्ययनों से पता चला है कि LN521 कैरियोटाइप असामान्यताओं के किसी भी लक्षण के बिना 10 से अधिक पीढ़ियों के लिए PSC विकास का समर्थन कर सकता है, और PSC की आंतरिक, मध्य और बाहरी रोगाणु परतों की तीन रोगाणु परतों में विभेदित करने की क्षमता को बनाए रखता है।
चित्र 1. लेमिनिन 521 संरचना [1]
2.लैमिनिन कोटिंग प्रयोग
2.1 लेमिनिन 521 को स्टेराइल डीआयनाइज्ड पानी या इंजेक्शन के लिए पानी के साथ 400µg/ml में तैयार करें। उपयोग से पहले स्टेराइल 1×DPBS (Ca++/Mg++) के साथ 100µg/ml तक पतला करने की सिफारिश की जाती है, और फिर स्टेराइल DPBS (Ca++/Mg++) के साथ 5-10µg/ml की कार्यशील सांद्रता तक पतला करें। कोटिंग सांद्रता संवर्धित कोशिकाओं के प्रकार के आधार पर भिन्न होती है, और कोशिकाओं के लिए इष्टतम कोटिंग सांद्रता निर्धारित करने के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने की सिफारिश की जाती है। अनुशंसित सांद्रता के लिए तालिका 1 देखें।
टिप्पणी: डीपीबीएस युक्त Ca2+ और एमजी2+ का उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि द्विसंयोजी धनायन प्रोटीन संरचना और कार्य के लिए महत्वपूर्ण हैं। लैमिनिन 521 की आवश्यक कार्यशील सांद्रता कोशिकाओं और अनुप्रयोग पर निर्भर करती है। हम 0.5μg/cm की प्रारंभिक कोटिंग सांद्रता की अनुशंसा करते हैं2.
तालिका 1. विभिन्न संवर्धन वाहिकाओं के लिए पुनः संयोजक मानव लेमिनिन कार्यशील विलयन की अनुशंसित मात्रा।
| पेट्री डिश | कोटिंग सांद्रता（μg/mL） | LN521 की अतिरिक्त राशि | 1*DPBS की अतिरिक्त राशि | कुल मात्रा |
| 6 अच्छी तरह से | 5 | 50 μL/वेल | 950 μL/वेल | 1 एमएल/वेल |
| 12 कुआं | 5 | 25 μL/वेल | 475 μL/वेल | 0.5 एमएल/वेल |
| 24 कुआं | 5 | 15 μL/वेल | 285 μL/वेल | 0.3 एमएल/वेल |
| 48 कुआं | 5 | 7.5 μL/वेल | 142.5 μL/वेल | 150 μL/वेल |
| 96 कुआं | 5 | 3.5 μL/वेल | 66.5 μL/वेल | 70 μL/वेल |
| 35 मिमी पेट्री डिश | 5 | 50 μL/वेल | 950 μL/वेल | 1 एमएल/वेल |
| 60 मिमी पेट्री डिश | 5 | 100 μL/वेल | 1900 μL/वेल | 2 एमएल/वेल |
| 100मिमी पेट्री डिश | 5 | 300 μL/वेल | 5700 μL/वेल | 6 एमएल/वेल |
उपरोक्त मात्रा 5μg/mL की कोटिंग सांद्रता पर आधारित है।
2.2 प्रत्येक वेल में लैमिनिन-डीपीबीएस मिश्रण की निर्दिष्ट मात्रा डालें और धीरे से हिलाएं। सुनिश्चित करें कि पूरी सतह लैमिनिन कोटिंग समाधान से ढकी हुई है, क्योंकि बिना कोटिंग वाली सतहें कोशिका वृद्धि का समर्थन नहीं करती हैं।
2.3. प्लेट को 37°C इनक्यूबेटर में रखें और रात भर इनक्यूबेट करें। न्यूनतम इनक्यूबेशन समय 2 घंटे है, लेकिन आदर्श सेल कल्चर स्थितियों को प्राप्त करने के लिए रात भर इनक्यूबेशन की सिफारिश की जाती है। सावधान रहें कि कल्चर कंटेनर सूखने न पाए, जिससे LN521 निष्क्रिय हो जाएगा।
2.4. जब कोशिकाएँ बीजरोपण के लिए तैयार हो जाएँ, तो लेमिनिन 521 घोल को चूस लें।
3.आईपीएससी संस्कृति
3.1 iPSC विगलन (उदाहरण के लिए 12-वेल प्लेट लेना)
3.1.1 iPSCs को तरल नाइट्रोजन या सूखी बर्फ से निकालें और 37°C पानी में 10 सेकंड के लिए पिघलाएं।
3.1.2 क्रायोवायल्स को 75% अल्कोहल से जीवाणुरहित करें और उन्हें कार्य सतह पर स्थानांतरित करें।
3.1.3 कोशिकाओं को 9 एमएल DMEM‑F12 युक्त एक नई 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
3.1.4 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
3.1.5 लेपित 12-वेल प्लेट से लेमिनिन विलयन को हटा दें।
3.1.6 सेल सुपरनैटेंट को हटा दें और iPSCs को 1 mL mTeSR-प्लस (जिसमें 10 µM Y-27632 होता है) में धीरे से फिर से सस्पेंड करें और उन्हें लेपित 12-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को 1×10^5 कोशिकाओं/वेल के अंतिम सेल घनत्व तक समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेट को हिलाएं और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े रहने दें। सुनिश्चित करें कि संस्कृति 4-5 दिनों के भीतर पारित हो जाती है।
3.1.7 12-वेल प्लेट को इन्क्यूबेशन के लिए 37°C इन्क्यूबेटर में वापस रखें।
3.1.8 आरओसीके अवरोधक युक्त संवर्धन माध्यम को 12-16 घंटों के बाद हटा दिया जाना चाहिए और अवरोधक रहित माध्यम में संवर्धन जारी रखना चाहिए।
तालिका 2. विभिन्न संवर्धन वाहिकाओं में कोशिका बीजारोपण घनत्व, कोशिका वृद्धि दर के अनुसार निर्धारित कोशिका संख्या
| कोशिका संवर्धन वाहिकाएँ | 6 अच्छी तरह से | 12 कुआं | 24 कुआं | 96 कुआं |
| सेल संख्या | 2.5~3.5×105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0.5~1×104 |
3.2. iPSC पासेजिंग प्रोटोकॉल
3.2.1 कल्चर सुपरनेटेंट को त्यागें और 1 एमएल पीबीएस (Ca .) से धो लें‑‑/एमजी‑‑).
टिप्पणी: PBS का प्रयोग Ca2+ और Mg2+ के बिना करें, क्योंकि द्विसंयोजी धनायनों का कुछ पृथक्करण एंजाइमों पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है।
3.2.2 पीबीएस को हटा दें और 0.5 एमएल जेंटल सेल डिसोसिएशन रिएजेंट मिलाएं।कमरे के तापमान पर 6-8 मिनट तक रखें या माइक्रोस्कोप के नीचे तब तक निरीक्षण करें जब तक कोशिकाएं प्लेट से बंधी हुई न रह जाएं।
3.2.3 बराबर मात्रा में DMEM-F12 डालें, कोशिकाओं को धीरे से मिलाएं, कमरे के तापमान पर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 5 मिनट के लिए 300g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
3.2.4 कोशिकाओं को पास करने से पहले, लेमिनिन-लेपित 12-वेल प्लेट तैयार करें।
3.2.5 सतह पर तैरनेवाला पदार्थ त्यागें और कोशिकाओं को 10 . युक्त mTeSR‑प्लस माध्यम में पुनः निलंबित करें माइक्रोन वाई-27632.
3.2.6 कोशिकाओं को तैयार लैमिनिन-लेपित 12-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेट को धीरे से हिलाएं और कमरे के तापमान पर 10 से 20 मिनट के लिए छोड़ दें।
3.2.7 12-वेल प्लेट को 37°C इनक्यूबेटर में रखें और इनक्यूबेट करें।
टिप्पणी: iPSCs तेजी से विभेदित हो जाएंगे और मोनोलेयर में बढ़ने के बाद मर जाएंगे। विकास और बहुलता बनाए रखने के लिए, उन्हें संगम से पहले मार्ग से गुजरना होगा।
3.3. iPSC का क्रायोप्रिजर्वेशन
3.3.1 सौम्य कोशिका पृथक्करण अभिकर्मक तैयार करें।
3.3.2 iPSC पासेजिंग प्रोटोकॉल के अनुसार कोशिका पृथक्करण करें, क्रायोप्रिजर्वेशन से पहले कोशिका घनत्व सुनिश्चित करने के लिए कोशिका अंगक गणना का उपयोग करें।
3.3.3 कोशिकाओं की प्रत्येक ट्यूब को 1-2×10^6 के सेल घनत्व पर जमाया जाना चाहिए। iPSC पासिंग प्रोटोकॉल में सेंट्रीफ्यूजेशन और सेल कल्चर माध्यम को हटाने के चरणों का पालन करें। क्रायोप्रिजर्वेशन समाधान की उचित मात्रा में पृथक iPSC गोली को फिर से निलंबित करें
3.3.4 1.5 एमएल क्रायोप्रिजर्वेशन ट्यूब में 1 एमएल पुनर्निलंबित सेल क्रायोप्रिजर्वेशन गोली डालें, प्रोग्राम कूलिंग करें, और फिर दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में स्थानांतरित करें।
4.लैमिनिन कोटिंग पर महत्वपूर्ण नोट्स
4.1. प्रायोगिक प्रोटोकॉल के सभी चरण जीवाणुरहित परिस्थितियों में निष्पादित किए जाने चाहिए।
4.2. लेमिनिन को लंबे समय तक कमरे के तापमान में रखने से बचें।
4.3. बार-बार जमने और पिघलने से बचें
4.4. विगलन के बाद, अनिर्दिष्ट प्रोटीन स्टॉक घोल को बाँझ परिस्थितियों में 2 ~ 8 ℃ पर संग्रहीत किया जा सकता है और कम से कम 3 महीने तक स्थिर रूप से संग्रहीत किया जा सकता है।
5.संबंधित उत्पाद जानकारी
| प्रोडक्ट का नाम | बिल्ली# | आकार |
| 92602ईएस | 10μg/100μg/500μg/1मिग्रा |
6.संदर्भ
[1]पुलिडो डी, ब्रिग्स डीसी, हुआ जे, होहेनस्टर ई. लेमिनिन β2 शॉर्ट आर्म के क्रिस्टलोग्राफिक विश्लेषण से पता चलता है कि एलएफ डोमेन को एलई डोमेन की नियमित सरणी में कैसे डाला जाता है। मैट्रिक्स बायोल। 2017 जनवरी;57-58:204-212।