puromycin स्ट्रेप्टोमाइसेस एल्बोनिगर द्वारा निर्मित एक एमिनोग्लाइकोसाइड एंटीबायोटिक है। यह एमिनोएसाइल-टीआरएनए अणु के 3' छोर का एक एनालॉग है और राइबोसोम के ए साइट से जुड़ सकता है, विस्तारित पेप्टाइड श्रृंखला में शामिल हो सकता है, राइबोसोम पर पेप्टाइड ट्रांसलोकेशन को बाधित कर सकता है, अनुवाद के दौरान समय से पहले श्रृंखला समाप्ति का कारण बन सकता है, और इस प्रकार प्रोटीन संश्लेषण को बाधित कर सकता है।
चित्र 1 प्यूरोमाइसिन (CAS संख्या 53-79-2) का संरचनात्मक सूत्र
प्यूरोमाइसिन एन-एसिटाइलट्रांसफेरेज़ (पीएसी) को एनकोड करने वाला पीएसी जीन, प्यूरोमाइसिन-उत्पादक जीवाणु स्ट्रेप्टोमाइसेस एल्बोनिगर में पाया गया, जो प्यूरोमाइसिन के प्रति प्रतिरोध प्रदान करता है। इस विशेषता का उपयोग अब व्यापक रूप से पीएसी जीन वाले प्लास्मिड ले जाने वाले स्तनधारी स्थिर ट्रांसफ़ेक्टेड सेल लाइनों की स्क्रीनिंग के लिए किया जाता है। स्थिर सेल लाइनों की स्क्रीनिंग में प्यूरोमाइसिन का व्यापक उपयोग लेंटिवायरल वेक्टर की विशेषताओं से संबंधित है, जिनमें से अधिकांश वाणिज्यिक लेंटिवायरल वेक्टर में पीएसी जीन ले जाते हैं। कुछ विशिष्ट मामलों में, प्यूरोमाइसिन का उपयोग पीएसी जीन ले जाने वाले प्लास्मिड के साथ रूपांतरित ई. कोली उपभेदों की स्क्रीनिंग के लिए भी किया जा सकता है। प्यूरोमाइसिन तेजी से कार्य करता है और कम सांद्रता पर जल्दी से कोशिका मृत्यु का कारण बन सकता है। आसंजक स्तनधारी कोशिकाएँ 2-5 µg/mL की सांद्रता के प्रति संवेदनशील होती हैं प्यूरोमाइसिन की, जबकि सस्पेंशन कोशिकाएं पहले से ही प्यूरोमाइसिन की 0.5-2 µg/mL जितनी कम सांद्रता के प्रति संवेदनशील हैं। प्यूरोमाइसिन के लिए स्थिर प्रतिरोध वाली स्तनधारी कोशिकाएं एक सप्ताह के भीतर उत्पन्न की जा सकती हैं।
स्थिर सेल लाइन स्क्रीनिंग
प्रायोगिक सिद्धांत
बहिर्जात डीएनए/shRNA को pac जीन ले जाने वाले वेक्टर में क्लोन करके, पुनः संयोजक वेक्टर को मेजबान कोशिकाओं में स्थानांतरित कर दिया जाता है और उनके गुणसूत्रों में एकीकृत कर दिया जाता है, कोशिका विभाजन के साथ स्थिर रूप से संचारित किया जाता है, और अंत में प्यूरोमाइसिन के साथ जांच की जाती है।
तैयारी और पूर्व-प्रयोग
1 अनुशंसित उपयोग सांद्रता
स्तनधारी कोशिकाएँ: 1-10 μg/mL, इष्टतम सांद्रता को पूर्व-प्रयोग द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए।
ई. कोली: एलबी अगर माध्यम पर पैक जीन ले जाने वाले स्थिर रूपांतरित ई. कोली की जांच के लिए, 125 μg/mL की सांद्रता का उपयोग करें। ई. कोली स्थिर ट्रांसफॉर्मेंट्स की प्यूरोमाइसिन जांच के लिए सटीक पीएच समायोजन की आवश्यकता होती है।
2 विघटन विधि
आसुत जल में प्यूरोमाइसिन को घोलकर 50 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक घोल तैयार करें, 0.22 माइक्रोन फिल्टर से छानकर जीवाणुरहित करें, विभाज्य बनाएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित करें।
3 प्यूरोमाइसिन किल कर्व का निर्धारण (उदाहरण के रूप में shRNA ट्रांसफ़ेक्शन या लेंटिवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके)
प्यूरोमाइसिन की प्रभावी स्क्रीनिंग सांद्रता कोशिका के प्रकार, वृद्धि की स्थिति, कोशिका घनत्व, कोशिका चयापचय और कोशिका चक्र की स्थिति से संबंधित है। प्यूरोमाइसिन की न्यूनतम सांद्रता निर्धारित करना महत्वपूर्ण है जो असंक्रमित कोशिकाओं को मार देती है। मार वक्र स्थापित करने के लिए पहले प्रयोग के लिए प्यूरोमाइसिन ग्रेडिएंट स्क्रीनिंग पूर्व-प्रयोग करना आवश्यक है।
- 5~8×10 घनत्व पर प्लेट कोशिकाएँ4कोशिकाओं/वेल को 24-वेल प्लेट में रखें और रात भर कल्चर करें।
- स्क्रीनिंग माध्यम तैयार करें: प्यूरोमाइसिन की विभिन्न सांद्रता युक्त ताजा माध्यम (जैसे, 0-15 μg/mL, कम से कम 5 ग्रेडिएंट)।
- ताजा तैयार स्क्रीनिंग माध्यम से प्रतिस्थापित करें, संवर्धन जारी रखें, तथा कोशिका वृद्धि का निरीक्षण करें, प्रत्येक 2-3 दिन में ताजा स्क्रीनिंग माध्यम बदलें।
- प्रतिदिन कोशिका के जीवित रहने का निरीक्षण करें; दवा की वह सांद्रता जो 4-6 दिनों के भीतर सभी गैर-संक्रमित कोशिकाओं को प्रभावी रूप से नष्ट कर दे, न्यूनतम सांद्रता है।
स्थिर ट्रांसफेक्टेंट्स की स्क्रीनिंग
- 48-72 घंटों (70-80% संगम) के लिए लेंटिवायरल संक्रमण के बाद, कम से कम 48 घंटों के लिए प्यूरोमाइसिन की उचित सांद्रता वाले माध्यम में कोशिकाओं को संवर्धित करें। जब प्यूरोमाइसिन के साथ गैर-ट्रांसफ़ेक्टेड नियंत्रण समूह की सभी कोशिकाएँ मर जाती हैं, तो वायरस-संक्रमित समूह की शेष कोशिकाएँ सभी सकारात्मक कोशिकाएँ होती हैं।
【नोट】: ① एंटीबायोटिक दवाओं का प्रभाव सबसे अधिक तब होता है जब कोशिकाएं सक्रिय विभाजन चरण में होती हैं। यदि कोशिकाएं बहुत घनी हैं, तो एंटीबायोटिक दवाओं की प्रभावकारिता काफी कम हो जाएगी। कोशिका घनत्व 25% से अधिक नहीं होना चाहिए। ② प्रतिदिन कोशिका वृद्धि की स्थिति का निरीक्षण करें; प्यूरोमाइसिन स्क्रीनिंग के लिए कम से कम 48 घंटे की आवश्यकता होती है, और प्यूरोमाइसिन स्क्रीनिंग की प्रभावी सांद्रता आमतौर पर 3 से 10 दिनों तक रहती है। वायरस का MOI जितना अधिक होता है, प्रत्येक कोशिका में shRNA और प्यूरोमाइसिन प्रतिरोध जीन की उतनी ही अधिक प्रतियां होती हैं। प्यूरोमाइसिन स्क्रीनिंग करते समय, MOI जितना अधिक होता है, कोशिकाओं में उतनी ही अधिक पीएसी प्रतियां होती हैं, और वे प्यूरोमाइसिन की उतनी ही अधिक सांद्रता सहन कर सकते हैं। ट्रांसफ़ेक्टेड कोशिकाओं को स्क्रीन करने के लिए प्यूरोमाइसिन की सांद्रता को समायोजित करें, लेकिन प्यूरोमाइसिन की सांद्रता किल कर्व की न्यूनतम प्रभावी सांद्रता से कम नहीं होनी चाहिए;
- कोशिकाओं को फैलाने के लिए प्यूरोमाइसिन की न्यूनतम सांद्रता युक्त संवर्धन माध्यम मिलाएं, और qPCR परीक्षण के परिणाम योग्य होने के बाद, क्रायोप्रिजर्वेशन के साथ आगे बढ़ें।
| उत्पादएस नाम | बिल्ली# | विनिर्देश | उपस्थिति |
| puromycin डाइहाइड्रोक्लोराइड सीएएस:58-58-2 | 60210ईएस25 | 25 मिलीग्राम | सफ़ेद से सफ़ेद पाउडर जैसा |
| 60210ES60 | 100 मिलीग्राम | ||
| 60210ES72 | 250 मिलीग्राम | ||
| 60210ES76 | 500 मिलीग्राम | ||
| 60210ES80 | 1 जी | ||
| puromycin (घोल 10 मिलीग्राम/एमएल) सीएएस:58-58-2 | 60209ईएस10 | 1×1 एमएल | समाधान（10 मिलीग्राम/एमएल एच में2ओ） |
| 60209ईएस50 | 5×1 एमएल | ||
| 60209ES60 | 10×1 एमएल | ||
| 60209ES76 | 50×1 एमएल |
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