आइसोथर्मल प्रवर्धन तकनीक निरंतर तापमान की स्थिति में विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमों को बढ़ाने के उद्देश्य को प्राप्त कर सकती है। किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं होने, कम प्रवर्धन समय और उच्च संवेदनशीलता की विशेषताओं के कारण, इसने ऑन-साइट डिटेक्शन और पॉइंट-ऑफ-केयर निदान में अच्छे अनुप्रयोग की संभावनाएं दिखाई हैं और आणविक नैदानिक ​​उपकरणों के विकास के लिए बहुत उपयुक्त है।

बढ़ते तनाव और संक्रामकता के साथ नए कोरोना वायरस महामारी के संदर्भ में, आइसोथर्मल प्रवर्धन तकनीक नए कोरोना वायरस का पता लगा सकती है सरल उपकरणों के साथ तेजी से परीक्षण करने से इस समस्या को हल करने में मदद मिलेगी कि कुछ COVID-19 रोगियों की पहचान लंबे समय तक पता लगाने और पारंपरिक पीसीआर तकनीकों के जांच उपकरणों और अभिकर्मकों की उच्च आवश्यकताओं के कारण जल्दी से पुष्टि नहीं की जा सकती है। तो आइसोथर्मल एम्पलीफिकेशन तकनीकों में से एक RT-LAMP का सिद्धांत क्या है? येसेन कौन से उच्च गुणवत्ता वाले कच्चे माल उपलब्ध करा सकता है?

1. RT-LAMP का सिद्धांत क्या है?
2. RT-LAMP के लिए प्राइमर डिज़ाइन
3. येसेन क्या कच्चा माल उपलब्ध करा सकता है?
4. उत्पाद चयन गाइड

1. RT-LAMP का सिद्धांत क्या है?

2000 में, जापानी विद्वान नोटोमी और अन्य ने लूप-मध्यस्थ आइसोथर्मल एम्पलीफिकेशन (LAMP) नामक एक नई न्यूक्लिक एसिड एम्पलीफिकेशन तकनीक की स्थापना की। LAMP लक्ष्य जीन के 6 क्षेत्रों के लिए डिज़ाइन किए गए 4 विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करता है, और आइसोथर्मल स्थितियों (60 ~ 65 ℃) के तहत दसियों मिनट में लक्ष्य अनुक्रम की 109 प्रतियों को बढ़ाने के लिए स्ट्रैंड विस्थापन डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करता है। परिणामों को एगरोस जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा आंका गया था, और सकारात्मक परिणामों ने सीढ़ी के आकार के बैंड दिखाए। LAMP में मजबूत विशिष्टता, उच्च संवेदनशीलता, तेज और सरल संचालन और कम लागत की विशेषताएं हैं। इस तकनीक के निरंतर सुधार और पूर्णता के साथ, इसका उपयोग वर्तमान में विभिन्न रोगजनक सूक्ष्मजीवों का पता लगाने में किया जाता है।

आरटी-एलएएमपी एक ऐसी विधि है जिसमें रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस को एलएएमपी प्रवर्धन प्रणाली में जोड़ा जाता है, जिससे वायरल आरएनए का प्रत्यक्ष पता लगाया जा सकता है। एलएएमपी की प्रवर्धन दक्षता बहुत अधिक है, इसलिए केवल थोड़ी मात्रा में सीडीएनए के साथ बड़ी मात्रा में न्यूक्लिक एसिड को प्रवर्धित किया जा सकता है। न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन प्रक्रिया में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन का समय बच जाता है, और आरएनए की पहचान की गति तेज हो जाती है।

डीएनए लगभग 65 डिग्री सेल्सियस पर गतिशील संतुलन की स्थिति में होता है। स्ट्रैंड विस्थापन डीएनए पोलीमरेज़ की क्रिया के तहत, FIP प्राइमर के F2 सेगमेंट के 3' छोर से शुरू होकर, इसे स्ट्रैंड विस्थापन डीएनए संश्लेषण आरंभ करने के लिए टेम्पलेट डीएनए के पूरक अनुक्रम के साथ जोड़ा जाता है। F3 प्राइमर F2c के सामने के छोर पर F3c का पूरक है और एक स्ट्रैंड विस्थापन डीएनए पोलीमरेज़ की क्रिया द्वारा अग्रणी FIP प्राइमर द्वारा संश्लेषित डीएनए स्ट्रैंड को प्रतिस्थापित करते हुए अपने डीएनए को संश्लेषित करने के लिए 3' छोर को शुरुआती बिंदु के रूप में लेता है। आगे बढ़ाएँ। अंतिम F3 प्राइमर द्वारा संश्लेषित डीएनए स्ट्रैंड एक टेम्पलेट डीएनए स्ट्रैंड के साथ एक दोहरा स्ट्रैंड बनाता है। FIP प्राइमर द्वारा संश्लेषित डीएनए स्ट्रैंड को एकल स्ट्रैंड उत्पन्न करने के लिए F3 प्राइमर स्ट्रैंड द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता और बीआईपी प्राइमर को हाइब्रिडाइज किया जाता है और एकल स्ट्रैंड के साथ संयोजित किया जाता है, और बीआईपी प्राइमर के 3' छोर को पूरक स्ट्रैंड को संश्लेषित करने के लिए शुरुआती बिंदु के रूप में उपयोग किया जाता है, और इस प्रक्रिया में संरचना को खोला जाता है।फिर, BIP प्राइमर से F3 और B3 के समान प्राइमर डाले जाते हैं, बेस कॉम्प्लीमेंट्री पेयरिंग की जाती है, और 3' छोर से एक नया कॉम्प्लीमेंट्री स्ट्रैंड संश्लेषित किया जाता है, जो शुरुआती बिंदु है। प्रतिस्थापित एकल-स्ट्रैंडेड डीएनए के दोनों सिरों पर पूरक अनुक्रम होते हैं, और स्व-बेस पेयरिंग एक गोलाकार संरचना बनाने के लिए होती है, इसलिए पूरी श्रृंखला एक डंबल जैसी संरचना प्रस्तुत करती है। यह संरचना RT-LAMP विधि के प्रवर्धन चक्र की शुरुआती संरचना है।

डंबल के आकार की संरचना में, डीएनए विस्तार 3' छोर पर F1 खंड को शुरुआती बिंदु के रूप में और खुद को एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग करके किया जाता है। और FIP प्राइमर F2 स्ट्रैंड विस्थापन प्रतिक्रिया के एक नए दौर को शुरू करने के लिए लूप पर एकल-स्ट्रैंडेड F2c के साथ संकरण करता है। F1 सेगमेंट से संश्लेषित डबल-स्ट्रैंडेड न्यूक्लिक एसिड को अलग कर दिया जाता है, और इसी तरह, न्यूक्लिक एसिड पर एक गोलाकार संरचना बनती है। गोलाकार संरचना पर B2c का एकल-स्ट्रैंडेड रूप होता है, और BIP प्राइमर पर B2 प्रवर्धन के एक नए दौर को शुरू करने के लिए इसके साथ संकरण करता है, और उसी प्रक्रिया के माध्यम से एक गोलाकार संरचना बनती है। इस प्रक्रिया के अनुसार, एक ही स्ट्रैंड पर पूरक अनुक्रम युग्मन, स्ट्रैंड विस्तार के माध्यम से चक्र करते हैं, और अंत में विभिन्न आकारों की संरचनाएं बनाते हैं।

2. RT-LAMP के लिए प्राइमर डिज़ाइन

प्राइमर डिजाइन RT-LAMP के सफल प्रवर्धन और पता लगाने की कुंजी है। RT-LAMP प्राइमरों में दो बाहरी प्राइमर (F3 और B3) और दो आंतरिक प्राइमर (FIP और BIP) शामिल हैं। F3 प्राइमर: F3 क्षेत्र से युक्त अपस्ट्रीम बाहरी प्राइमर, लक्ष्य जीन के F3c क्षेत्र का पूरक है। FIP प्राइमर: F2 क्षेत्र से युक्त अपस्ट्रीम आंतरिक प्राइमर, F2 क्षेत्र में लक्ष्य जीन के 3' छोर पर F2c क्षेत्र लक्ष्य जीन के 5' छोर पर F1c क्षेत्र का पूरक है। BIP प्राइमर: B2 क्षेत्र से बना डाउनस्ट्रीम आंतरिक प्राइमर, B2 क्षेत्र लक्ष्य जीन के 3' छोर पर B2c क्षेत्र का पूरक है, और इसका लक्ष्य जीन के 5' छोर पर B1c क्षेत्र के समान अनुक्रम है।

पीसीआर की तरह, प्राइमर डिजाइन सिद्धांतों को आधार संरचना, जीसी सामग्री और उप-संरचना जैसे कारकों पर ध्यान देना चाहिए। इसके अलावा, निम्नलिखित बिंदुओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए। आंतरिक प्राइमरों एफआईपी और बीआईपी के 5' अंत भाग, यानी एफ1सी और बी1सी, आम तौर पर लंबाई में 8-50 बीपी होते हैं। लंबाई अधिमानतः 15 से 25 बीपी है, और टीएम मूल्य 3' अंत भाग पर एफ2 और बी2 के टीएम मूल्यों से अधिक है। आंतरिक प्राइमरों एफआईपी और बीआईपी के 3' अंत भाग, यानी एफ2 और बी2, आम तौर पर लंबाई में 8-50 बीपी होते हैं। लंबाई अधिमानतः 15-25 बीपी है, और टीएम मूल्य प्रयोग में चयनित बीएसटी डीएनए पोलीमरेज़ के इष्टतम तापमान के अनुरूप है। बाहरी प्राइमरों F3 और B3 की लंबाई आम तौर पर 8-50 बीपी होती है। लंबाई अधिमानतः 15-25 बीपी है, और इसका टीएम मूल्य एफ 2 और बी 2 की तुलना में छोटा है। प्राइमरों को डिजाइन करते समय, लूप संरचना और लक्ष्य अनुक्रम के आकार पर विचार किया जाना चाहिए। जब ​​लूप में आधारों की संख्या 40 बीपी से अधिक होती है और लक्ष्य अनुक्रम का आकार 130-200 बीपी होता है, तो प्रवर्धन दक्षता सबसे अधिक होती है।

3. येसेन क्या कच्चा माल उपलब्ध करा सकता है?

3.1 [नया अपग्रेड] येसेन बीएसटी प्लस डीएनए पॉलीमरेज़

नव उन्नत Hieff™ बीएसटी प्लस डीएनए पोलीमरेज़ (कैट#14402ES, 14403ES) बैसिलस स्टीयरोथर्मोफिलस के डीएनए पॉलीमरेज़ जीन को व्यक्त और शुद्ध करके प्राप्त किया जाता है एसपी ई.कोली में 5′→3′ एक्सोन्यूक्लिऐस डोमेन का अभाव है।एंजाइम स्ट्रैंड विस्थापन क्षमता मजबूत है, और इसमें उच्च संवेदनशीलता, उच्च प्रवर्धन दक्षता और उच्च डीयूटीपी सहिष्णुता के फायदे हैं, और इसका व्यापक रूप से आइसोथर्मल प्रवर्धन तकनीक के आधार पर रोगजनकों का वास्तविक समय का पता लगाने में उपयोग किया जा सकता है।

3.1.1 तेज़ और उच्च संवेदनशीलता

येसेन हिएफ़™ बीएसटी प्लस डीएनए पॉलीमरेज़ में उच्च संवेदनशीलता है और यह लक्ष्य जीन को 5 प्रतियों से भी कम में पहचान सकता है। टेम्पलेट की मात्रा फेमटोग्राम (एफजी) स्तर पर है, और प्रवर्धन दर प्रतिस्पर्धी उत्पादों की तुलना में तेज़ है।

चित्र 1. RT-LAMP प्रतिक्रिया येसेन के साथ की गई SARS-CoV-2 को बढ़ाने के लिए प्रतियोगी N (ग्रे) और प्रतियोगी T (नीला) के Hieff™ Bst Plus DNA पॉलीमरेज़ (नारंगी) और Bst एंजाइम। परिणाम बताते हैं कि येसेन Hieff™ Bst Plus DNA पॉलीमरेज़ हमेशा प्रतिस्पर्धी उत्पादों की तुलना में तेज़ी से सीमा तक पहुँच सकता है, और प्रवर्धन दर तेज़ होती है।

4. उत्पाद चयन गाइड

येसेन द्वारा उपलब्ध कराए गए उत्पाद इस प्रकार हैं:

तालिका नंबर एक।उत्पाद की जानकारी