आणविक निदान IVD के क्षेत्र में सबसे तेजी से विकसित होने वाला उपक्षेत्र है। इसमें कम समय में पता लगाने, उच्च संवेदनशीलता और मजबूत विशिष्टता के फायदे हैं। इसका व्यापक रूप से ट्यूमर सहवर्ती निदान और संक्रामक रोगों और आनुवंशिक रोगों की जांच में उपयोग किया जाता है। आणविक निदान के क्षेत्र में, पीसीआर न केवल सबसे बड़ी बाजार हिस्सेदारी के साथ सबसे परिपक्व प्रौद्योगिकी मंच है, बल्कि नैदानिक निदान की "स्वर्ण मानक" तकनीक भी है। पारंपरिक पीसीआर प्रतिक्रिया में, गैर-विशिष्ट प्रवर्धन की समस्या अक्सर होती है। गैर-विशिष्ट प्रवर्धन सीधे पता लगाने के परिणामों की व्याख्या को प्रभावित करता है और प्रवर्धन संवेदनशीलता और यहां तक कि लक्ष्य टुकड़ों की उपज में गिरावट का कारण बनेगा। गैर-विशिष्ट प्रवर्धन कैसे होता है और इसे प्रभावी ढंग से कैसे टाला जा सकता है?
1. पारंपरिक डीएनए पॉलीमरेज़ से अविशिष्ट प्रवर्धन हो सकता है
2. हॉट स्टार्ट पॉलीमरेज़ प्रवर्धन विशिष्टता में सुधार कर सकता है
3. डबल-ब्लॉक टैक एंटीबॉडी प्रवर्धन विशिष्टता और स्थिरता में दोगुना सुधार कर सकता है
4. येसेन के डबल-ब्लॉक टैक का प्रदर्शन प्रदर्शन एंटीबॉडी
5. उत्पाद की जानकारी
1. पारंपरिक डीएनए पॉलीमरेज़ से अविशिष्ट प्रवर्धन हो सकता है
प्राइमर की खराब अनुक्रम विशिष्टता गैर-विशिष्ट प्रवर्धन का प्रत्यक्ष कारण है। पारंपरिक डीएनए पॉलीमरेज़ के प्रवर्तक के रूप में, इसकी एक्सोन्यूक्लिअस गतिविधि पीसीआर प्रणाली की तैयारी के दौरान डीएनए प्राइमर अनुक्रम को छोटा कर सकती है, जिससे प्राइमर की विशिष्टता कम हो जाती है।
इसके अलावा, पारंपरिक डीएनए पोलीमरेज़ में न केवल एक्सोन्यूक्लिअस गतिविधि होती है, बल्कि पोलीमरेज़ गतिविधि भी होती है। हालाँकि डीएनए पोलीमरेज़ का इष्टतम विस्तार तापमान 72 ℃ है, लेकिन पोलीमरेज़ कमरे के तापमान पर अभी भी सक्रिय है। इसलिए, पीसीआर प्रतिक्रिया और प्रारंभिक हीटिंग प्रक्रिया की तैयारी के दौरान, प्राइमर कुछ एकल स्ट्रैंड टेम्प्लेट के साथ गैर-विशिष्ट बंधन बना सकते हैं और टैक डीएनए पोलीमरेज़ की कार्रवाई के तहत विस्तारित हो सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप गैर-लक्ष्य अनुक्रमों का प्रवर्धन होता है और प्रतिक्रिया की विशिष्टता प्रभावित होती है।
इसलिए, डीएनए पोलीमरेज़ की गतिविधि को बाधित करने के लिए पीसीआर सिस्टम को अक्सर बर्फ पर कॉन्फ़िगर किया जाता है। हालांकि यह विधि सरल और सस्ती है, लेकिन यह एंजाइम गतिविधि को पूरी तरह से बाधित नहीं कर सकती है, इसलिए यह गैर-विशिष्ट उत्पादों के प्रवर्धन को समाप्त नहीं कर सकती है।
2. हॉट स्टार्ट पॉलीमरेज़ प्रवर्धन विशिष्टता में सुधार कर सकता है
हॉट स्टार्ट पॉलीमरेज़ हॉट स्टार्ट पीसीआर का मुख्य घटक है। कमरे के तापमान पर, डीएनए पॉलीमरेज़ की सक्रिय साइट को एंजाइम संशोधक द्वारा अवरुद्ध किया जाता है। 95 डिग्री सेल्सियस पर पीसीआर विकृतीकरण के बाद ही, एंजाइम संशोधक बंद हो जाता है और एंजाइम गतिविधि शुरू हो जाती है, जिससे एंजाइम के कारण होने वाले गैर-विशिष्ट प्रवर्धन से बचा जा सकता है।
वर्तमान में, बाजार में डीएनए पोलीमरेज़ के सामान्य रूप से उपयोग किए जाने वाले हॉट स्टार्ट संशोधन तरीकों में मुख्य रूप से एक रासायनिक विधि, लिगैंड विधि और एंटीबॉडी विधि शामिल हैं। उनमें से, एंटीबॉडी-संशोधित हॉट स्टार्ट पोलीमरेज़ का अवरोध प्रभाव सबसे अच्छा है, और एंजाइम गतिविधि की रिलीज की गति तेज है, जो पीसीआर के प्रतिक्रिया समय को बहुत कम कर सकती है। यह आईवीडी बाजार में व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली एक हॉट स्टार्ट एंजाइम संशोधन विधि है।
हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पारंपरिक एंटीबॉडी हॉट स्टार्ट विधि केवल टैक डीएनए पॉलीमरेज़ की 5'→3' पॉलीमरेज़ गतिविधि को अवरुद्ध करती है, जो केवल कम तापमान पर बेमेल या प्राइमर डिमर के कारण होने वाले गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को रोक सकती है।हालाँकि, जैसा कि ऊपर बताया गया है, टैक डीएनए पॉलीमरेज़ में न केवल 5'→3' पॉलीमरेज़ गतिविधि होती है, बल्कि 5'→3' एक्सोन्यूक्लिएज़ गतिविधि भी होती है। यह एक्सोन्यूक्लिएज़ गतिविधि कम तापमान पर बेमेल जांच या अन्य सामग्रियों के क्षरण का कारण बन सकती है, जिसके परिणामस्वरूप कुछ गैर-विशिष्ट संकेत मिलते हैं।
3. डबल-ब्लॉक टैक एंटीबॉडी प्रवर्धन विशिष्टता और स्थिरता में दोगुना सुधार कर सकता है
घरेलू आणविक एंजाइम उद्योग में एक अभिनव नेता के रूप में, येसेन बायोटेक्नोलॉजी (शंघाई) कंपनी लिमिटेड (जिसे आगे येसेन कहा जाता है) आणविक एंजाइम कच्चे माल के अनुसंधान एवं विकास और उत्पादन पर ध्यान केंद्रित करती है और नवाचार करने का साहस करती है। अपने स्वयं के परिपक्व एंटीबॉडी स्क्रीनिंग प्लेटफ़ॉर्म पर भरोसा करते हुए, यह लक्ष्य अणु के रूप में टैक डीएनए पॉलीमरेज़ के साथ अवरुद्ध एंटीबॉडी को स्क्रीन करता है। वर्षों के श्रमसाध्य अनुसंधान और सिस्टम अनुकूलन के बाद, इसने विकसित किया है डबल-ब्लॉक एंटी-टैक डीएनए पॉलीमरेज़ एंटीबॉडी, यह न केवल टैक डीएनए पोलीमरेज़ की पोलीमरेज़ गतिविधि को अवरुद्ध कर सकता है, बल्कि टैक डीएनए पोलीमरेज़ की एक्सोन्यूक्लिअस गतिविधि को भी अवरुद्ध कर सकता है। दो-आयामी दृष्टिकोण में, यह न केवल बेमेल या प्राइमर डिमर के कारण होने वाले गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को प्रभावी ढंग से रोक सकता है, बल्कि गैर-विशिष्ट संकेतों को उत्पन्न करने से सामग्री क्षरण को भी रोक सकता है, और अभिकर्मक की स्थिरता में दोगुना सुधार कर सकता है।
4. येसेन के डबल-ब्लॉक टैक का प्रदर्शन प्रदर्शन एंटीबॉडी
4.1 डबल-ब्लॉक टैक एंटीबॉडी का उपयोग सटीक और अधिक संवेदनशील है
येसेन के डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी के साथ टैक पॉलीमरेज़ को अवरुद्ध करने के बाद और टी कंपनी के एंटीबॉडी, सकारात्मक नमूनों का पता एआरएमएस-पीसीआर द्वारा लगाया गया।
चित्र 1. एआरएमएस-पीसीआर प्रवर्धन वक्र; नीला: टी कंपनी का अवरोधक एंटीबॉडी; लाल: येसेन का डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी
चित्र 1 से देखा जा सकता है कि येसेन के डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी द्वारा अवरुद्ध टैक पॉलीमरेज़ में ARMS-PCR प्रवर्धन में सटीक टाइपिंग और उच्च संवेदनशीलता है।
4.2 डबल-ब्लॉक टैक एंटीबॉडी प्रभावी रूप से टैक डीएनए पॉलीमरेज़ की एक्सोन्यूक्लिऐस गतिविधि को अवरुद्ध किया गया
संश्लेषित प्राइमर जांच को क्रमशः बंद और डबल-अवरुद्ध एंटीबॉडी द्वारा अवरुद्ध टैक डीएनए पॉलीमरेज़ के प्रतिक्रिया समाधान के साथ मिलान किया गया और उनके प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया की गई।
चित्र 2. एक्सोन्यूक्लिऐस गतिविधि के लिए डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी की अवरोधन दक्षता का पता लगाना; पीला: खुला टैक डीएनए पॉलीमरेज़ समूह; बैंगनी: डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी द्वारा अवरुद्ध टैक डीएनए पॉलीमरेज़ समूह
इसे चित्र 2 से देखा जा सकता है डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी टैक डीएनए पॉलीमरेज़ की एक्सोन्यूक्लिऐस गतिविधि को प्रभावी रूप से अवरुद्ध कर सकती है।
4.3 डबल-ब्लॉक टैक एंटीबॉडी डिटेक्शन रिएजेंट की स्थिरता को प्रभावी ढंग से सुधार सकता है
टैक डीएनए पॉलीमरेज़ को क्रमशः पारंपरिक ब्लॉकिंग एंटीबॉडी और डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी के साथ ब्लॉक किया गया और प्राइमर जांच युक्त पूर्ण प्रीमिक्स में कॉन्फ़िगर किया गया। ASF प्लास्मिड की 10000 प्रतियों को 10 दिनों के लिए 4℃ पर या 1, 3, और 5 दिनों के लिए 37℃ पर प्रवर्धित किया गया। प्रवर्धन वक्र और सीटी मान में परिवर्तन देखे गए, और पूर्ण प्रीमिक्स प्रतिक्रिया समाधान की स्थिरता पर पारंपरिक ब्लॉकिंग एंटीबॉडी और डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी के प्रभावों की तुलना की गई।
चित्र तीन।पारंपरिक अवरोधक एंटीबॉडी (ए) और डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी (बी) अवरोधक प्रतिक्रिया समाधान द्वारा प्रवर्धित एएसएफ प्लाज्मिड की 10000 प्रतियों का प्रवर्धन वक्र; नीला: 10 दिनों के लिए 4℃ पर स्टोर करें; लाल: 0 दिनों के लिए 4℃ पर रखा गया (नियंत्रण)
चित्र 3 से यह देखा जा सकता है कि डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी प्रतिक्रिया समाधान की स्थिरता को बनाए रख सकती है और पारंपरिक ब्लॉकिंग एंटीबॉडी की तुलना में डिटेक्शन अभिकर्मक की स्थिरता को प्रभावी ढंग से सुधार सकती है। पूरे प्रीमिक्स युक्त प्राइमर जांच को डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी द्वारा अवरुद्ध करने और 10 दिनों के लिए 4 ℃ पर रखने के बाद प्रवर्धन वक्र और सीटी मूल्य में महत्वपूर्ण रूप से बदलाव नहीं आया।
चित्र 4. पारंपरिक अवरोधक एंटीबॉडी (ए) और डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी (बी) अवरोधक प्रतिक्रिया समाधान द्वारा प्रवर्धित एएसएफ प्लाज्मिड की 10000 प्रतियों का प्रवर्धन वक्र; नीला: 5 दिनों के लिए 37℃ पर स्टोर करें; हरा: 3 दिनों के लिए 37℃; पीला: 1 दिन के लिए 37℃; लाल: 0 दिनों के लिए 37℃ पर रखा गया (नियंत्रण)
चित्र 4 से देखा जा सकता है कि डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी प्रतिक्रिया समाधान की स्थिरता को बनाए रख सकती है और पारंपरिक अवरोधक एंटीबॉडी की तुलना में प्रभावी रूप से पता लगाने वाले अभिकर्मक की स्थिरता में सुधार कर सकती है। डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी प्राइमर-जांच युक्त पूरे प्रीमिक्स को ब्लॉक करती है, और 1, 3, और 5 दिनों के लिए 37 ℃ पर रखे जाने के बाद सीटी मूल्य का अंतर 0.2 से कम है।
4.4 डबल-ब्लॉक टैक एंटीबॉडी बेसलाइन बहाव की समस्या को हल करने में मदद करती है
जब कुछ प्राइमर एक विशिष्ट बफर और उपकरणों के साथ सहयोग करते हैं, तो बेसलाइन बहाव होगा। येसेन ने बेसलाइन समस्या को सुधारने के लिए कई तरीके आजमाए और पाया कि डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी एक स्थिर बेसलाइन के लिए अधिक अनुकूल थी।
चित्र 5. एन जीन (ए) और एसीटी जीन (बी) का प्रवर्धन वक्र; लाल: पारंपरिक अवरोधक एंटीबॉडी; हरा: डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी
जैसा कि चित्र 5 से देखा जा सकता है, विशिष्ट प्राइमरों और बफर्स के अंतर्गत डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी का उपयोग बेसलाइन बहाव की समस्या को हल करने में मदद कर सकता है।
4.5 डबल-ब्लॉक टैक एंटीबॉडी का उपयोग करके अच्छी रैखिकता प्राप्त की गई
एएसएफ/एसीटी डबल प्लास्मिड की 100000, 10000, 1000, और 100 प्रतियों को डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी द्वारा अवरुद्ध प्रतिक्रिया समाधान के साथ प्रवर्धित किया गया, और मानक वक्र बनाया गया।
चित्र 6. डबल-ब्लॉक प्रतिक्रिया समाधान द्वारा उत्पादित एएसएफ जीन (ए) और एसीटी जीन (बी) के मानक वक्र
जैसा कि चित्र 6 से देखा जा सकता है, मानक वक्र R2 एएसएफ जीन का प्रवर्धन 0.998 है, और प्रवर्धन दक्षता 98.848% है; मानक वक्र R2 ACT जीन का प्रतिशत 0.998 था और प्रवर्धन दक्षता 98.113% थी।
4.6 डबल-ब्लॉक टैक एंटीबॉडी तेजी से एंजाइम गतिविधि जारी कर सकती है
टैक पॉलीमरेज़ को आयातित टी कंपनी के एंटीबॉडी से ब्लॉक किया गया और येसेन का डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी (कैट#31303) क्रमशः, और 20 सेकंड के लिए 95 ℃ पर हीट शॉक के बाद एंजाइम गतिविधि का पता चला था। यह देखा जा सकता है कि 31303 20 सेकंड के लिए 95 ℃ पर हीट शॉक के बाद 95% से अधिक एंजाइम गतिविधि जारी कर सकता है, जो टी कंपनी के एंटीबॉडी के बराबर है।
तालिका 1. एंजाइम गतिविधि
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| प्रोटोएंजाइम | येसेन का डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी (95℃, 20 सेकंड) | टी कंपनी की एंटीबॉडी（95℃, 20 एस） |
| एंजाइम गतिविधि -U/μL | 2.15 | 2.1 | 2.2 |
4.7 डबल-ब्लॉक टैक एंटीबॉडी कई प्रकार के Taq एंजाइमों को अवरुद्ध कर सकता है
तीन प्रकार के टैक एंजाइम (वाइल्ड टाइप और 2 म्यूटेंट) को येसेन के डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी (कैट # 31303) द्वारा ब्लॉक किया गया, और ब्लॉकिंग अनुपात 1 μ g: 5 U था, जो फ्लोरोसेंस वैल्यू और सीलिंग दक्षता को मापता है। यह देखा जा सकता है कि येसेन के डबल-ब्लॉक एंटीबॉडी (कैट # 31303) का ब्लॉकिंग प्रभाव विभिन्न प्रकार के टैक एंजाइमों के लिए बेहतर है।
तालिका 2. विभिन्न प्रकार के Taq एंजाइमों की अवरोधन दक्षता
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| प्रतिदीप्ति मान | अवरोधन दक्षता |
| खाली | 6461.74 |
|
| प्रोटोएंजाइम-Taq000 | 56221.33 |
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| प्रोटोएंजाइम-Taq019E | 50819.64 |
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| प्रोटोएंजाइम-Taq019H | 56466.33 |
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| 31303-Taq000 | 7949.68 | 97.01% |
| 31303-Taq019E | 8267.35 | 95.93% |
| 31303-Taq019H | 8015.47 | 96.90% |
4.8 येसेन डबल-ब्लॉक टैक एंटीबॉडी का चूहों में कोई जीनोमिक अवशेष नहीं था
नकारात्मक नियंत्रण के लिए टेम्पलेट के रूप में पानी और सकारात्मक नियंत्रण के लिए टेम्पलेट के रूप में माउस जीनोम लेते हुए, 31303 अलग-अलग बैचों को प्रवर्धित किया गया। यह पाया गया कि नमूने में लक्ष्य खंड प्रवर्धित नहीं था, जो दर्शाता है कि एंटीबॉडी में कोई माउस जीनोम अवशेष नहीं था।
चित्र 7. माउस जीनोम अवशेष पहचान आरेख
नोट: - नकारात्मक नियंत्रण है, + सकारात्मक नियंत्रण है, और 1-5 विभिन्न बैचों के 31303 नमूने हैं
5. उत्पाद जानकारी
येसेन द्वारा उपलब्ध कराए गए उत्पाद इस प्रकार हैं:
टेबल तीन।उत्पाद की जानकारी
| प्रोडक्ट का नाम | एसकेयू | विशेष विवरण |
| हाईएफ़™ डबल ब्लॉक ताक़ विरोधी डीएनए पोलीमर्स एंटीबॉडी | 31303ईएस | 100μg/1मिग्रा/5मिग्रा/10मिग्रा/100मिग्रा/1000मिग्रा |
| हाईफ़ यूनिकॉन™ हॉटस्टार्ट ई-टैक डीएनए पॉलीमरेज़ | 10726ईएस | 250यू/500यू/1000यू/10केयू/100केयू |
| Hieff™ Taq डीएनए पोलीमरेज़ | 10101ईएस | 1केयू/10केयू |
| हाईफ़ यूनिकॉन™ हॉटस्टार्ट टैक डीएनए पोलीमरेज़ | 10729ईएस | 250यू/500यू/1000यू/10केयू/100केयू |
पढ़ने के संबंध में:
अफ़्रीकी स्वाइन फीवर वायरस - कुल मास्टर मिक्स/प्रत्यक्ष प्रवर्धन qPCR समाधान