पीसीआर प्रयोगों में टैक डीएनए पोलीमरेज़ का गैर-विशिष्ट प्रवर्धन एक आम समस्या है, जो सीधे पहचान परिणामों की व्याख्या को प्रभावित करती है और प्रवर्धन संवेदनशीलता में कमी ला सकती है, और यहां तक ​​कि लक्ष्य खंड की उपज में भी कमी ला सकती है। कमरे के तापमान पर टैक डीएनए पोलीमरेज़ के सक्रिय केंद्र को सील करने के लिए एंजाइम संशोधक का उपयोग करना, जिससे कमरे के तापमान पर टैक एंजाइम की डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि बाधित होती है, वर्तमान में गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को दबाने का सबसे प्रभावी तरीका है। यिशेंग द्वारा विकसित दोहरे-सीलिंग एंटीबॉडी न केवल टैक डीएनए पोलीमरेज़ की पोलीमरेज़ गतिविधि को सील करते हैं, बल्कि साथ ही टैक डीएनए पोलीमरेज़ की एक्सोन्यूक्लिअस गतिविधि को भी सील करते हैं। यह दोहरा दृष्टिकोण गलत जोड़ी या प्राइमर डिमर्स के कारण होने वाले गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को प्रभावी ढंग से रोकता है और सामग्री क्षरण के कारण गैर-विशिष्ट संकेतों की पीढ़ी को भी रोकता है, जिससे अभिकर्मक की विशिष्टता दोगुनी हो जाती है। यह पहचान अभिकर्मकों को परिवहन या कमरे के तापमान के उपयोग से आसानी से निपटने में सक्षम बनाता है।

1.अति-उच्च प्रवर्धन विशिष्टता - दोहरे-सील वाले एंटीबॉडी एक साथ पॉलीमरेज़ और एक्सोन्यूक्लिऐस दोनों गतिविधियों को सील कर सकते हैं, जिससे गैर-विशिष्ट प्रवर्धन से प्रभावी रूप से बचा जा सकता है और विशिष्टता को बढ़ाया जा सकता है।

2.असाधारण पहचान संवेदनशीलता - हॉट-स्टार्ट फॉर्मूलेशन कम-प्रचुरता वाले जीनों की प्रभावी पहचान सुनिश्चित करता है, जिससे उच्च संवेदनशीलता प्राप्त होती है।

3.उत्कृष्ट उत्पाद स्थिरता - 5 दिनों के लिए 37°C या 10 दिनों के लिए 4°C पर रखे जाने पर प्रदर्शन में स्थिर।

4.आधार रेखा स्थिरता और अच्छी रैखिकता - आधार रेखा विचलन के मुद्दे को संबोधित करना, जिसके परिणामस्वरूप उत्कृष्ट रैखिकता प्राप्त होती है।

5.तीव्र एंजाइम गतिविधि विमोचन - 95°C पर 20 सेकंड तक गर्म करने से 95% से अधिक एंजाइम गतिविधि विमोचित की जा सकती है।

6.एंजाइमों की व्यापक प्रयोज्यता - वन्य-प्रकार और उत्परिवर्ती Taq एंजाइमों दोनों के लिए उपयुक्त, एंटीबॉडी का प्रत्येक मिलीग्राम Taq एंजाइम के 4-10 KU को सील करने में सक्षम है।

1 टैक डीएनए पॉलीमरेज़ एक्सोन्यूक्लिऐस गतिविधि को अवरुद्ध करना

सिंथेटिक प्राइमर जांच को क्रमशः टैक डीएनए पॉलीमरेज़ के प्रतिक्रिया मिश्रण में शामिल किया गया था जो या तो बिना सील किए गए थे या दोहरे बंद एंटीबॉडी के साथ सील किए गए थे, और प्रतिक्रियाएं 40 डिग्री सेल्सियस पर आयोजित की गईं। दोनों के प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाया गया, और यह पाया गया कि दोहरे बंद एंटीबॉडी टैक डीएनए पॉलीमरेज़ की एक्सोन्यूक्लिअस गतिविधि को प्रभावी ढंग से सील कर सकते हैं।

चित्र 2. डबल-सील एंटीबॉडी-एंडोन्यूक्लिऐस गतिविधि की सीलिंग दक्षता का पता लगाना।

02 पता लगाने की संवेदनशीलता का सत्यापन

यीसेन के डबल-सील एंटीबॉडी और टी कंपनी के एंटीबॉडी का उपयोग करके टैक एंजाइम को सील करने के बाद, एआरएमएस-पीसीआर तकनीक के माध्यम से सकारात्मक नमूनों का पता लगाने पर, यह पाया गया कि यीसेन के डबल-सील एंटीबॉडी द्वारा सील किया गया टैक एंजाइम एआरएमएस-पीसीआर प्रवर्धन में उच्च संवेदनशीलता के साथ सटीक था।

लाल: YEASEN एंटीबॉडी+Taq; नीला:आपूर्तिकर्ता A एंटीबॉडी+Taq.

चित्र 3. ARMS-PCR का प्रवर्धन वक्र।

03 स्थिरता सत्यापन (10 दिनों के लिए 4°C, 5 दिनों के लिए 37°C).

टैक डीएनए पॉलीमरेज़ को क्रमशः ब्लॉक करने के लिए पारंपरिक बंद एंटीबॉडी और डबल-बंद एंटीबॉडी का उपयोग करके, पॉलीमरेज़ को प्राइमर और जांच युक्त एक पूर्ण प्रीमिक्स समाधान में तैयार किया जाता है। इस घोल को 10 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या 1, 3 और 5 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर छोड़ दिया जाता है, और फिर ASF प्लास्मिड की 10,000 प्रतियों को बढ़ाने के लिए उपयोग किया जाता है। यह देखा गया कि प्रवर्धन वक्र और सीटी मानों में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं थे।

चित्र 4. Taq पॉलीमरेज़ को पारंपरिक अवरोधक एंटीबॉडी (A) और डबल-अवरुद्ध एंटीबॉडी (B) के साथ अवरुद्ध करने के बाद ASF प्लास्मिड की 10,000 प्रतियों के प्रवर्धन वक्र, qPCR की प्रणाली द्वारा प्रवर्धित.

04 आधारभूत जांच

कुछ स्थितियों में जहाँ विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग विशेष बफर्स ​​और उपकरणों के साथ किया जाता है, वहाँ बेसलाइन ड्रिफ्ट नामक घटना हो सकती है। हालाँकि, डबल-क्लोज्ड एंटीबॉडी का उपयोग बेसलाइन ड्रिफ्ट की समस्या को प्रभावी ढंग से संबोधित कर सकता है, जिससे अधिक स्थिर बेसलाइन की सुविधा मिलती है।

चित्र 5. qPCR विश्लेषण में SARS-CoV-2 N जीन (A) और ACT जीन (B) के प्रवर्धन वक्र।

05 रैखिकता सत्यापन

डबल-क्लोज्ड एंटीबॉडी से सील किए गए रिएक्शन मिश्रण का उपयोग ASFV/ACT दोहरे प्लास्मिड की 100,000, 10,000, 1,000 और 100 प्रतियों को बढ़ाने के लिए किया गया ताकि एक मानक वक्र उत्पन्न किया जा सके। जैसा कि चित्र 7 से देखा जा सकता है, दोनों अच्छी रैखिकता प्रदर्शित करते हैं।

चित्र 6. डबल-ब्लॉक प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग करके उत्पन्न ASFV जीन और ACT जीन के लिए मानक वक्र ग्राफ।

06 एंजाइमेटिक गतिविधि रिलीज परख

टैक एंजाइम को सील करने के लिए येसेन से डबल-क्लोज्ड एंटीबॉडी (कैट#31303) का उपयोग करके, और इसे 95°C पर 20 सेकंड के लिए थर्मल शॉक के अधीन करके, एंजाइमेटिक गतिविधि का पता लगाया गया। यह देखा जा सकता है कि 95°C पर 20 सेकंड के थर्मल शॉक के बाद, 31303 95% से अधिक एंजाइमेटिक गतिविधि जारी कर सकता है, जो कंपनी टी के एंटीबॉडी के बराबर है।

तालिका 1. एंजाइम को 20 सेकंड के लिए 95°C पर हीट शॉक दिया गया।

07 मल्टीप्लेक्स टैक पॉलीमरेज़ डिटेक्शन

येसेन के डबल-क्लोज्ड एंटीबॉडी (कैट#31303) का उपयोग तीन प्रकार के टैक पॉलीमरेज़ (वाइल्ड-टाइप + दो म्यूटेंट टाइप) को सील करने के लिए किया गया, जिसमें सीलिंग अनुपात 1μg से 5U था, और फ्लोरोसेंस मान और सीलिंग दक्षता को मापा गया। यह पाया गया कि विभिन्न प्रकार के टैक पॉलीमरेज़ के लिए, येसेन के डबल-क्लोज्ड एंटीबॉडी (कैट#31303) ने अच्छा सीलिंग प्रभाव प्रदर्शित किया।

तालिका 2. विभिन्न प्रकार के टैक पॉलीमरेज़ की अवरुद्ध दक्षता।