जैसे-जैसे चिकित्सा अनुसंधान आगे बढ़ता जा रहा है, लक्षित चिकित्सा अधिक परिपक्व होती जा रही है। लक्षित उपचार का आधार दवाओं के आणविक लक्ष्यों पर आनुवंशिक परीक्षण करना है ताकि उन जीन उत्परिवर्तनों की पहचान की जा सके जो वंशानुगत विकारों या दुर्दमताओं का कारण बनते हैं। ARMS-PCR PCR पर आधारित एक नई विधि है जो कई DNA बिंदु उत्परिवर्तनों का पता लगा सकती है। वर्तमान में, यह कैंसर की अनुकूलित आनुवंशिक पहचान के लिए सबसे आवश्यक और व्यापक तरीकों में से एक है। इसके चिकित्सीय उपयोग के लाभों को क्षेत्र के विशेषज्ञों द्वारा अच्छी तरह से स्वीकार किया गया है।

1. एलील-विशिष्ट पीसीआर कैसे काम करता है?
2. ARMS विशिष्टता में सुधार कैसे करें?
3. येसेन द्वारा उपलब्ध कराए गए उत्पादों की विशेषताएं क्या हैं?
4. उत्पाद प्रदर्शन डेटा क्या हैं?
5. लोग उत्पाद कैसे ऑर्डर करते हैं?

1. एलील-विशिष्ट पीसीआर कैसे काम करता है?

ARMS-PCR का मतलब एम्प्लीफिकेशन रिफ्रैक्टरी म्यूटेशन सिस्टम PCR (ARMS-PCR) है, जिसे एलील-स्पेसिफिक PCR (AS-PCR) के नाम से भी जाना जाता है। एलील-स्पेसिफिक एक्सटेंशन को वाइल्ड-टाइप एलील और म्यूटेंट वाइल्ड-टाइप जीन की पहचान करने के लिए विनियमित किया जाता है, और फ्लोरोसेंस सिग्नल वैल्यू को टैकमैन जांच तकनीक का उपयोग करके मापा जाता है।
ARMS PCR प्राइमर्स को एलील के दो अपस्ट्रीम प्राइमर्स के 3' छोर पर अलग-अलग न्यूक्लियोटाइड्स के साथ डिज़ाइन किया गया है, और दो प्राइमर क्रमशः वाइल्ड टाइप और म्यूटेंट टाइप के लिए विशिष्ट हैं। प्रवर्धन के दौरान, अपस्ट्रीम प्राइमर जो टेम्पलेट से पूरी तरह मेल नहीं खाते हैं, वे पूरक बेस पेयर बनाने में असमर्थ होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप बेमेल, बाधित विस्तार और PCR उत्पाद बनाने में असमर्थता होती है, जबकि प्राइमर सिस्टम जो टेम्पलेट से मेल खाते हैं, वे संबंधित PCR उत्पादों को बढ़ा सकते हैं। टैकमैन जांच पर फ्लोरोफोर एक फ्लोरोसेंट सिग्नल उत्सर्जित कर सकता है जिसे डिवाइस द्वारा पता लगाया जा सकता है, और फ्लोरोसेंस डेटा का मूल्यांकन करके जीनोटाइप को मान्य किया जा सकता है।
ARMS तकनीक में उच्च संवेदनशीलता है, पता लगाने की सीमा 100 प्रतियों/एमएल तक पहुँच सकती है, और ट्यूमर ऊतक के लिए पता लगाने की सीमा 0.5% उत्परिवर्तन दर तक पहुँच सकती है। इसके अलावा, ARMS समय लेने वाली और कम लागत वाली है, और परिणाम सहज और न्याय करने में आसान हैं। ऐसा इसलिए है क्योंकि qPCR या वैद्युतकणसंचलन तकनीक के साथ संयुक्त ARMS के लिए केवल एक PCR प्रतिक्रिया की आवश्यकता होती है, जिसमें कम समय लगता है। केवल अपस्ट्रीम प्राइमरों को ARMS तकनीक के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है, जिसमें MGB जांच का उपयोग करके वास्तविक समय PCR तकनीक की तुलना में कम लागत और सहज परिणाम हैं। चूंकि पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक नमूनों से निकाले गए अधिकांश डीएनए खंडित होते हैं, इसलिए सटीक पता लगाने के परिणाम प्राप्त नहीं किए जा सकते हैं। ARMS विधि को लक्ष्य उत्पाद की लंबाई को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिससे पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक में इस कठिनाई को संबोधित किया जा सके। उसी समय, PCR प्लेटफ़ॉर्म के साथ संयुक्त ARMS बंद-ट्यूब ऑपरेशन का एहसास करता है, जो संचालित करने के लिए सरल है और उत्पाद पोस्ट-प्रोसेसिंग की आवश्यकता नहीं है, इस प्रकार प्रवर्धन उत्पादों के संदूषण से सबसे बड़ी सीमा तक बचा जाता है।
सैद्धांतिक रूप से, कुशल पोलीमराइजेशन करने के लिए टैक डीएनए पोलीमरेज़ को प्राइमर के 3' छोर पर शेष टेम्पलेट के लिए पूरी तरह से पूरक होना चाहिए। हालांकि, टैक डीएनए की कठोरता कई कारकों से प्रभावित होती है। कुछ मामलों में, प्राइमर का 3' टर्मिनल बेस टेम्पलेट के पूरक न होने पर भी विस्तार हो सकता है। यदि 3' छोर पर केवल एक बेस बेमेल है, तो प्राइमर बेमेल हो सकते हैं और विस्तारित हो सकते हैं, लेकिन विस्तार दक्षता कम है। अलग-अलग 3' छोर अव्यवस्थाओं में अलग-अलग विस्तार क्षमताएं होती हैं। यदि 3' छोर पर अन्य बेमेल बेस पेश किए जाते हैं, तो बेमेल की संख्या बहुत बड़ी है, और 3' छोर को एक निश्चित स्तर के बाद विस्तारित नहीं किया जा सकता है।इसलिए, प्राइमर के 3' छोर पर केवल एक आधार बेमेल दो एलीलों में पर्याप्त रूप से अंतर नहीं कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप गलत सकारात्मक परिणाम प्राप्त होते हैं।

2. ARMS विशिष्टता में सुधार कैसे करें?

ARMS विशिष्टता में सुधार का ध्यान प्राइमर विस्तार विशिष्टता में सुधार करना है। 3' छोर से दूसरे या तीसरे आधार पर एक बेमेल आधार पेश किया जा सकता है। बेमेल आधार 3' छोर पर बेमेल आधारों के साथ मिलकर काम करते हैं, और उस टेम्पलेट में जो 3' छोर के पूरक नहीं है, प्राइमर प्रवर्धन उत्पाद दर कम हो जाती है। जबकि प्राइमर अपने 3' छोर के पूरक टेम्पलेट में सामान्य रूप से प्रवर्धित होते हैं, प्राइमर के बेमेल आधारों का प्रकार 3' छोर पर आधार बेमेल के प्रकार पर निर्भर करता है।
ARMS के लिए विशिष्ट प्राइमरों के डिज़ाइन किए जाने के बाद, एलील-विशिष्ट प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण के लिए TaqMan जांच की एक जोड़ी की आवश्यकता होती है। TaqMan जांच में दो फ्लोरोसेंट रंग होते हैं, 5' छोर एक फ्लोरोसेंट जीन होता है, और 3' छोर पर एक सामान्य फ्लोरोसेंस शमन जीन होता है। एक पूर्ण जांच में, शमन करने वाला जीन और फ्लोरोजेनिक जीन स्थानिक रूप से एक दूसरे के बहुत करीब होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंस शमन होता है। सामान्य परिस्थितियों में, 5' छोर पर फ्लोरोफोर द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति का पता नहीं लगाया जा सकता है, और केवल 3' छोर पर शमन करने वाले की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति का पता लगाया जा सकता है। लक्ष्य जीन प्रवर्धन की प्रक्रिया में, पीसीआर प्राइमर और फ्लोरोसेंटली लेबल वाली जांच दोनों ही डी-ओआर के दौरान लक्ष्य अनुक्रम के पूरक होंगे। जब टैक एंजाइम टेम्पलेट स्ट्रैंड को बढ़ाते समय टेम्पलेट से स्थिर रूप से बंधे हुए प्रोब का सामना करता है, तो टैक एंजाइम का 5'-3' एक्सोन्यूक्लिएज टेम्पलेट से बंधे विशिष्ट प्रोब को ख़राब कर देगा। प्रोब पर फ्लोरोफोर को भौतिक स्थान द्वारा अलग किया जाता है, शमन प्रभाव गायब हो जाता है, और प्रतिदीप्ति उत्सर्जित होती है। कमज़ोर फ्लोरोसेंट प्रोब और लक्ष्य अनुक्रमों के बीच बेमेल होने से जारी प्रतिदीप्ति की मात्रा कम हो जाएगी।

चित्र 1 ARMS-PCR की मूलभूत अवधारणा

3. येसेन द्वारा उपलब्ध कराए गए उत्पादों की विशेषताएं क्या हैं?

YEASEN Hieff Unicon™ मल्टीप्लेक्स ARMS qPCR मिक्स एक किट है जो प्रवर्धन ब्लॉक अवधारणा पर आधारित है जो कुशल ARMS-PCR-मध्यस्थ जीनोटाइपिंग की अनुमति देता है।

👍उच्च चयनात्मकता: कई जीन उत्परिवर्तनों की पहचान करने में सक्षम;
👍उच्च संवेदनशीलता: उत्परिवर्ती प्राइमर 10 एनजी / एल डीएनए में 0.5% जितनी कम सांद्रता पर उत्परिवर्तन का पता लगा सकते हैं;
👍पढ़ने में सरल: परिणाम स्पष्ट हैं और वस्तुनिष्ठ रूप से मूल्यांकन किया गया है, और यह सीधा और सरल है;
👍संचालन में सरल: यह विभिन्न पीसीआर उपकरणों के साथ संगत है, संचालन का तरीका मानकीकृत है, तथा ऑन-बोर्ड जांच 90 मिनट में पूरी की जा सकती है।

4. उत्पाद प्रदर्शन डेटा क्या हैं?

4.1 बेहतर उत्पाद अवरोध प्रभाव

प्रयोग: 5L टेम्पलेट इनपुट, 10 ng/L वाइल्ड-टाइप टेम्पलेट, तथा समतुल्य मात्रा में उत्परिवर्ती प्लास्मिड को उत्परिवर्ती प्राइमरों का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया
साइट: KRASG13D（38G>A）
लाल：13755; नीला: प्रतिस्पर्धी

चित्र 2 दर्शाता है कि वाइल्ड-टाइप प्राइमर वाइल्ड-टाइप और म्यूटेंट दोनों टेम्पलेट्स को बढ़ाते हैं। प्रवर्धन वक्र के अनुसार, वाइल्ड-टाइप टेम्पलेट में कोई शिखर नहीं होता है या वाइल्ड-टाइप और म्यूटेंट के बीच Ct मान में अंतर 6-8 होता है, जिससे वाइल्ड-टाइप और म्यूटेंट जीन को प्रभावी ढंग से पहचाना जा सकता है।

4.2 उत्पाद पहचान की दर 0.05% तक पहुंच सकती है

प्रयोग 1: स्व-मिश्रण मानक तैयारी तकनीक (50%): 50μL 10ng/μL वन्य-प्रकार डीएनए और उत्परिवर्ती प्लाज्मिड की 50μL 3X103 प्रतियां।
साइट：KRASG13D(38G>A)

चित्र 3. प्रवर्धन वक्र के अनुसार, उत्पाद 0.05% की सांद्रता पर प्रभावी ढंग से काम करना जारी रखता है

प्रयोग 2: खरीदे गए 5% मानक (50ng/μL) को लाइब्रेरी मंदक के साथ 10ng/μL तक पतला किया गया, फिर 10ng/μL 293g DNA के साथ 0.1% और 0.05% तक पतला किया गया।
साइट：L858R
लाल：13755; नीला: प्रतिस्पर्धी

चित्र 4: प्रवर्धन वक्र के अनुसार, 10 ng/μL की वाइल्ड-टाइप gDNA पृष्ठभूमि के विरुद्ध लोकी की पहचान दर 0.05% जितनी अधिक हो सकती है, और वाणिज्यिक मानकों द्वारा अनुवर्ती सत्यापन यह दर्शाता है कि हमारे उत्पादों की पहचान दर उत्कृष्ट है।

4.3 उत्कृष्ट उत्पाद स्थिरता

उत्पाद के प्रवर्धन और अवरोधन प्रभाव, ठंड और विगलन के 10 चक्रों से अप्रभावित रहते हैं।
प्रयोग: लाल: -20°C; हरा: वास्तविक फ्रीज-थॉ 5 बार; नीला: वास्तविक फ्रीज-थॉ 8 बार; बैंगनी: वास्तविक फ्रीज-थॉ 10 बार।
साइट：L858R

चित्र 5 दर्शाता है कि अभिकर्मक 13755 को दस बार बार-बार जमाने और पिघलाने से इसके प्रवर्धन और अवरोधन गुणों पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है।

इसका प्रवर्धन और अवरोधन प्रभाव 7 दिनों तक 37 °C से अप्रभावित रहता है।
प्रयोग: लाल: -20°C; हरा और बैंगनी: 37°C, 7 दिनों के लिए।
साइट：L858R

चित्र 6 दर्शाता है कि 37°C पर सात दिनों का 13755 अभिकर्मक के प्रवर्धन और अवरोधन क्रिया पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है।

5. लोग उत्पाद कैसे ऑर्डर करते हैं?

2014 में स्थापित येसेन बायोटेक्नोलॉजी (शंघाई) कंपनी लिमिटेड एक उच्च तकनीक उद्यम है जो टूल एंजाइम कच्चे माल और एंटीजन एंटीबॉडी के अनुसंधान एवं विकास और उत्पादन में लगा हुआ है। इसके उत्पादों में आणविक नैदानिक ​​एंजाइम, प्रोटीन और एंटीबॉडी शामिल हैं जिनका उपयोग फार्मास्यूटिकल्स, खाद्य सुरक्षा परीक्षण, प्रजनन, न्याय और अन्य उद्योगों में किया जाता है। हम जीवन विज्ञान के क्षेत्र में ग्राहकों को उच्च गुणवत्ता वाले उत्पाद और सेवाएँ प्रदान करने के लिए प्रतिबद्ध हैं। येसेन द्वारा प्रदान किए जा सकने वाले उत्पाद इस प्रकार हैं:

तालिका 1: येसेन द्वारा उपलब्ध कराए गए उत्पाद