मार्च 2022 से, चालाक ओमिक्रॉन म्यूटेंट स्ट्रेन ने एक बार फिर लोगों के शांतिपूर्ण जीवन को तोड़ दिया, पूरे देश में नोवेल कोरोनावायरस महामारी फैल गई और 30 प्रांतों (स्वायत्त क्षेत्रों और नगर पालिकाओं) को प्रभावित किया। SARS-CoV-2 महामारी की सटीक रोकथाम और नियंत्रण के एक प्रभावी साधन के रूप में, न्यूक्लिक एसिड का पता लगाना जीवन का एक सामान्य तरीका बन गया है। "क्या आपने आज न्यूक्लिक एसिड टेस्ट किया?" यह लोगों का दैनिक अभिवादन भी बन गया है। जिसके बारे में बोलते हुए, क्या आप जानते हैं कि न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में किन मुख्य कच्चे माल की आवश्यकता होती है? यह लेख न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन एंजाइम में महत्वपूर्ण मुख्य कच्चे माल का परिचय देगा।

1. SARS-CoV-2 के लिए न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की प्रक्रिया

2. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण में मुख्य एंजाइम

3. RT-qPCR के दौरान मुख्य एंजाइम

4. येसेन से SARS-CoV-2 न्यूक्लिक एसिड डिटेक्शन के कोर एंजाइम

1. SARS-CoV-2 के लिए न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की प्रक्रिया

एंजाइम उच्च उत्प्रेरक दक्षता और प्रतिक्रिया विशिष्टता के साथ जैव उत्प्रेरक का एक अत्यंत महत्वपूर्ण वर्ग है। अधिकांश जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं में एंजाइमों की भागीदारी की आवश्यकता होती है। 2019-nCoV (चित्र 1 में दिखाया गया है) के न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की प्रक्रिया में, विभिन्न प्रकार के आणविक एंजाइम न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और RT-qPCR जैसे विभिन्न प्रयोगात्मक चरणों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। इसके बाद, न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने में विभिन्न प्रयोगात्मक लिंक के अनुसार, हम न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले मुख्य एंजाइम कच्चे माल को छांटेंगे।

चित्र 1. SARS-CoV-2 के लिए न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की प्रक्रिया

2. न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण में मुख्य एंजाइम

नोवेल कोरोनावायरस न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण प्रक्रिया में मुख्य रूप से दो चरण शामिल हैं: लिसिस और शुद्धिकरण। लिसिस नमूने की कोशिका संरचना को नष्ट करने की प्रक्रिया है ताकि नमूने में न्यूक्लिक एसिड लिसिस सिस्टम में मुक्त हो; शुद्धिकरण लिसिस सिस्टम में अन्य घटकों, जैसे प्रोटीन, नमक और अन्य अशुद्धियों से न्यूक्लिक एसिड का पूर्ण पृथक्करण है, और प्रतिक्रिया प्रक्रिया में प्रोटीनेज K, डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिअस I और RNase अवरोधकों की भागीदारी की आवश्यकता होती है।

2.1 प्रोटीएज़ के

प्रोटीनेज K एक सेरीन प्रोटीज है जिसमें व्यापक दरार गतिविधि होती है, दरार स्थल एलिफैटिक और एरोमैटिक अमीनो एसिड के कार्बोक्सी-टर्मिनल पेप्टाइड बॉन्ड होते हैं (चित्र 2)। न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण की प्रक्रिया में, प्रोटीनेज K हिस्टोन को नष्ट कर सकता है जो न्यूक्लिक एसिड के साथ कसकर बंधे होते हैं, न्यूक्लिक एसिड के पृथक्करण को बढ़ावा देते हैं, और सैंपल न्यूक्लिक एसिड को निकालना आसान बनाते हैं। इसके अलावा, प्रोटीनेज K RNA हाइड्रोलेस (RNase) गतिविधि को नष्ट कर सकता है और टेम्पलेट RNA के RNase हाइड्रोलिसिस को बाधित कर सकता है।

चित्र 2. प्रोटीनेज़ K हाइड्रोलाइज़िंग पेप्टाइड बॉन्ड का योजनाबद्ध आरेख

येसेन बायोटेक प्रोटीनेज़ K (कैट#10401ES) पुनः संयोजक यीस्ट स्ट्रेन से प्राप्त होता है, विशिष्ट गतिविधि ≥30 U/mg, RNase और DNase से मुक्त, और यूरिया और SDS घोल में स्थिर एंजाइम गतिविधि। यह एक विस्तृत pH रेंज (pH 4.0~12.0) में सक्रिय है, जो प्रोटीन के विभाजन और निष्कासन के लिए उपयुक्त है जैसे कि इन सीटू हाइब्रिडाइजेशन नमूना तैयार करना और न्यूक्लिक एसिड शुद्धिकरण।

2.2 डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिऐस I

डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिऐस I (DNase I) DNA के विभिन्न रूपों को उत्प्रेरित कर सकता है, पिरिमिडीन के समीपस्थ फॉस्फोडाइएस्टर बंधों के विदलन को लक्ष्य बना सकता है, तथा 5' छोर पर फॉस्फेट समूह तथा 3' छोर पर हाइड्रॉक्सिल समूह वाले पॉलीन्यूक्लियोटाइड उत्पन्न कर सकता है, औसत पाचन उत्पाद सबसे छोटा पॉलीटेट्रान्यूक्लियोटाइड होता है।SARS-CoV-2 न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण की प्रक्रिया में, DNase I का उपयोग मुख्य रूप से RNA नमूनों में जीनोमिक संदूषण को हटाने, RNA टेम्पलेट्स में DNA अवशेषों से बचने और टेम्पलेट्स की शुद्धता में सुधार करने के लिए किया जाता है।

येसेन बायोटेक डीएनएस I (कैट#10325ES) पुनः संयोजक ई. कोली उपभेदों से प्राप्त होता है, RNase-मुक्त होता है, और विभिन्न RNA नमूनों के उपचार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इष्टतम कार्यशील pH रेंज 7.0-8.0 है। Mg2+ की उपस्थिति में, DNase I डबल-स्ट्रैंडेड DNA की किसी भी साइट को बेतरतीब ढंग से काट सकता है; जबकि Mn की उपस्थिति में²⁺, डीएनएसे I एक ही स्थान पर दोहरे स्ट्रैंड वाले डीएनए को विभाजित कर सकता है, जिससे कुंद सिरे या 1-2 न्यूक्लियोटाइड लटकते हुए चिपचिपे सिरे बनते हैं (चित्र 3 में दिखाया गया है)।

चित्र 3. Mg की उपस्थिति में DNase I द्वारा dsDNA को विभाजित करने का योजनाबद्ध आरेख²⁺ और एमएन²⁺

2.3 आरएनेज अवरोधक

SARS-CoV-2 न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की प्रक्रिया में, सैंपल न्यूक्लिक एसिड का निष्कर्षण और शुद्धिकरण या प्रायोगिक प्रतिक्रिया प्रणाली की तैयारी से राइबोन्यूक्लिअस (RNase) संदूषण हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप RNA टेम्पलेट का क्षरण हो सकता है। RNase संदूषण से बचने के लिए, RNase अवरोधक की आवश्यकता होती है।

RNase अवरोधक मानव प्लेसेंटा में एक विशिष्ट RNase अवरोधक है, जो विशेष रूप से RNase को बांधकर एक गैर-सहसंयोजक बंधन के साथ एक जटिल बना सकता है और RNase को निष्क्रिय कर सकता है। येसेन बायोटेक म्यूरिन आरएनेज़ अवरोधक (कैट#10603ES) में दो सिस्टीन नहीं होते हैं जो मानव प्रोटीन में ऑक्सीकरण के प्रति बहुत संवेदनशील होते हैं। इसमें उच्च एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि होती है और यह विभिन्न प्रकार के RNases (RNase A, B, C) को व्यापक रूप से बाधित कर सकता है, जो qPCR जैसे उच्च डिथियोथ्रेटॉल (DTT) के प्रति संवेदनशील प्रयोगों के लिए अधिक उपयुक्त है।

3. RT-qPCR के दौरान मुख्य एंजाइम

SARS-CoV-2 नमूने के न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के पूरा होने के बाद, RT-qPCR द्वारा न्यूक्लिक एसिड का पता लगाना पूरा किया जा सकता है। इन प्रयोगों की प्रक्रिया में, डीएनए पोलीमरेज़, रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस और यूरैसिल डीएनए ग्लाइकोसिलेज़ सभी आवश्यक कोर एंजाइम कच्चे माल हैं।

3.1 रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस

निष्कर्षण और शुद्धिकरण के बाद, SARS-CoV-2 RNA को टेम्पलेट RNA (चित्र 4) के पूरक cDNA अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए dNTP पोलीमराइजेशन को उत्प्रेरित करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस की आवश्यकता होती है। RT-qPCR प्रतिक्रिया के लिए, उच्च तापमान प्रतिरोधी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का चयन किया जाना चाहिए। वर्तमान में, MMLV रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस सबसे व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, क्योंकि इसमें DNA एंडोन्यूक्लिअस गतिविधि की कमी और RNase H गतिविधि कम होती है, इसलिए cDNA क्लोनिंग के अनुप्रयोग में इसके अधिक फायदे हैं।

चित्र 4. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया का योजनाबद्ध आरेख

येसेन बायोटेक हाईफेयर™ वी रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस (कैट#11300ES) जेनेटिक इंजीनियरिंग तकनीक द्वारा प्राप्त एक नया रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस है। इसमें अच्छी थर्मल स्थिरता है और यह 60 डिग्री सेल्सियस तक के प्रतिक्रिया तापमान को झेल सकता है। और यह भी जटिल द्वितीयक संरचनाओं वाले आरएनए टेम्पलेट्स के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए उपयुक्त है। साथ ही, एंजाइम टेम्पलेट के साथ आत्मीयता को बढ़ाता है, कम संख्या में टेम्पलेट्स और कम-कॉपी जीन के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए उपयुक्त है, और 10 केबी तक सीडीएनए को बढ़ा सकता है।

3.2 डीएनए पॉलीमरेज़

डबल-स्ट्रैंडेड सीडीएनए उत्पन्न करने के लिए टेम्पलेट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया पूरी होने के बाद, पीसीआर प्रतिक्रिया में "सोल प्लेयर" डीएनए पॉलीमरेज़ को डीएनए श्रृंखला का विस्तार करने के लिए मुक्त डीऑक्सीराइबोन्यूक्लियोटाइड्स को पॉलीमराइज़ करके उपस्थिति बनाने की आवश्यकता होती है, और वायरल न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए बड़ी मात्रा में टेम्पलेट डीएनए को इन विट्रो में प्रवर्धित किया जाता है।

RT-qPCR प्रतिक्रियाओं में आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला डीएनए पॉलीमरेज़ हॉट-स्टार्ट टैक डीएनए पॉलीमरेज़ है। इस प्रकार का एंजाइम कमरे के तापमान पर निष्क्रिय रहता है।इसमें केवल गर्म-शुरुआत के बाद ही पोलीमराइजेशन गतिविधि होती है, जो पृष्ठभूमि संकेतों की पीढ़ी को कम कर सकती है। यह पारंपरिक पीसीआर प्रतिक्रियाओं में प्राइमर-डिमर पीढ़ी या बेमेल के कारण होने वाले गैर-विशिष्ट प्रवर्धन की समस्याओं को हल करता है। वर्तमान में, आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले डीएनए पोलीमरेज़ हॉट-स्टार्ट संशोधन विधियों में मुख्य रूप से रासायनिक संशोधन, लिगैंड संशोधन और एंटीबॉडी संशोधन शामिल हैं। विभिन्न हॉट-स्टार्ट संशोधन विधियों के सिद्धांतों को चित्र 5 में दिखाया गया है।

चित्र 5. विभिन्न प्रकार के संशोधित हॉट-स्टार्ट एंजाइमों का योजनाबद्ध आरेख

येसेन बायोटेक UNICONTM हॉटस्टार्ट हाई स्पेसिफिक टैक डीएनए पोलीमरेज़, 5 U/μL (कैट#10726ES) एक डबल-ब्लॉकिंग हॉट-स्टार्ट डीएनए पॉलीमरेज़ है जिसमें उच्च टेम्पलेट आत्मीयता है। कमरे के तापमान पर, न केवल 5'→3' पॉलीमरेज़ गतिविधि अवरुद्ध हो जाती है, लेकिन 5'→3' भी अवरुद्ध हो जाती है एक्सोन्यूक्लिअस गतिविधि अवरुद्ध हो जाती है। 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण अवरुद्ध एंटीबॉडी को पूरी तरह से निष्क्रिय कर सकता है, डीएनए पॉलीमरेज़ गतिविधि और एक्सोन्यूक्लिअस गतिविधि को मुक्त कर सकता है। डबल-ब्लॉकिंग सुविधा न केवल बेमेल या प्राइमर-डिमर्स के कारण होने वाले गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को प्रभावी ढंग से रोक सकती है, बल्कि जांच गिरावट के कारण होने वाले प्रतिदीप्ति संकेत की कमी को भी प्रभावी ढंग से रोक सकती है। डबल गारंटी इन विट्रो डिटेक्शन अभिकर्मकों को परिवहन या कमरे के तापमान पर उपयोग के दौरान अधिक स्थिर बनाती है।

3.3 यूरेसिल डीएनए ग्लाइकोसिलेज

नए कोरोनावायरस न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने की प्रक्रिया में, ऑपरेटिंग वातावरण में एरोसोल प्रदूषण सबसे आम कारक है जो गलत सकारात्मक पीसीआर परिणाम पैदा करता है। प्रवर्धन प्रणाली में यूडीजी एंजाइम (यूरैसिल डीएनए ग्लाइकोसिलेज, यूरैसिल डीएनए ग्लाइकोसिलेज) को जोड़ने से पीसीआर प्रणाली में मिश्रित प्रवर्धन अवशिष्ट प्रदूषकों (ज्यादातर एरोसोल के रूप में) को प्रभावी ढंग से समाप्त किया जा सकता है ताकि प्रवर्धन परिणामों की सटीकता सुनिश्चित हो सके। यूडीजी एंजाइम का प्रदूषण-रोधी सिद्धांत चित्र 6 में दिखाया गया है।

चित्र 6. यूडीजी एंजाइम के प्रदूषण-विरोधी सिद्धांत का योजनाबद्ध आरेख

येसेन बायोटेक यूरेसिल डीएनए ग्लाइकोसिलेज (UDG/UNG), हीट-लेबिल, 1 U/μL (कैट#10303ES) 25-37°C पर सक्रिय है, हीट-सेंसिटिव है, और 50°C पर 10 मिनट या 95°C पर 2 मिनट के लिए अपरिवर्तनीय रूप से निष्क्रिय है। कोई एंडोन्यूक्लिएज और RNase अवशेष नहीं है, और मेजबान बैक्टीरिया जीनोम अवशेष 10 प्रतियों से कम है। प्रवर्धन प्रतिक्रिया की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए इसे हॉट-स्टार्ट टैक डीएनए पॉलीमरेज़ के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है।

4.येसेन से SARS-CoV-2 न्यूक्लिक एसिड का पता लगाने के मुख्य एंजाइम

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