dNTP का मतलब है पैटर्न्ड राइबोन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट, जिसका इस्तेमाल पीसीआर में किया जाता है, जो बढ़ते डीएनए स्ट्रैंड को बढ़ाने में सक्षम है। दूसरे शब्दों में, पीसीआर में dNTPs हाइड्रोजन बॉन्ड के माध्यम से पूरक डीएनए स्ट्रैंड के साथ जुड़ते हैं, और बढ़ते डीएनए स्ट्रैंड को टैक डीएनए पॉलीमरेज़ की मदद से बढ़ाया जाता है। पीसीआर में dNTP का विशिष्ट अनुप्रयोग क्या है? उच्च शुद्धता वाले dNTPs में कौन से गुण होने चाहिए?

1. डीएनटीपी क्या हैं?
2. पीसीआर में डीएनटीपी की सांद्रता कितनी है?
3. उच्च शुद्धता वाले dNTP के आवश्यक गुण क्या हैं?
4. संबंधित उत्पाद और प्रदर्शन

1. डीएनटीपी क्या हैं?

डीऑक्सीन्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट (dNTPs) न्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट होते हैं जिनमें डीऑक्सीराइबोज होता है, जो राइबोज, एक बेस और एक फॉस्फेट से मिलकर बनी न्यूक्लियोटाइड की एक श्रृंखला है। dNTPs न्यूक्लिक एसिड अणुओं के आवश्यक निर्माण खंड हैं, और इस तरह PCR मिश्रणों के आवश्यक घटक हैं क्योंकि उनके बिना कोई नया प्रवर्धित DNA उत्पन्न नहीं किया जा सकता है। चार अलग-अलग डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड जो डीऑक्सीएडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (dATP), डीऑक्सीथाइमिडीन ट्राइफॉस्फेट (dTTP), डीऑक्सीसाइटिडीन ट्राइफॉस्फेट (dCTP), और डीऑक्सीगुआनोसिन ट्राइफॉस्फेट (dGTP) सहित एक DNA अनुक्रम बनाते हैं। इसके अलावा, dNTPs की गुणवत्ता PCR, cDNA संश्लेषण, qPCR, अनुक्रमण, क्लोनिंग और DNA लेबलिंग जैसी कई प्रक्रियाओं की सफलता के लिए भी महत्वपूर्ण है।

डीएनटीपी या डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट के चार प्रकार हैं, जिनमें से प्रत्येक एक अलग डीएनए बेस का उपयोग करता है: एडेनिन (डीएटीपी), साइटोसिन (डीसीटीपी), गुआनिन (डीजीटीपी), और थाइमिन (डीटीटीपी)। विस्तार चरण के दौरान डीएनटीपी का उपयोग करने से डीएनए में जाने और इसे दोगुना करने के लिए तैयार एकल बेस मिलते हैं, जैसे बिल्डिंग ब्लॉक। चूँकि इस तकनीक का उद्देश्य नए डीएनए को संश्लेषित करना है, इसलिए dNTP एक तरफ के टेम्पलेट का उपयोग करके "अनज़िप्ड" स्ट्रैंड को न्यूक्लियोटाइड प्रदान करता है। यह डीएनए के एक स्ट्रैंड को दो में बदल देता है, और जब तक अभिकर्मक अंतिम होल्ड चरण तक मौजूद रहते हैं, तब तक यह तेजी से जारी रह सकता है।

2. पीसीआर में डीएनटीपी की सांद्रता कितनी है?

पीसीआर डीएनए संश्लेषण की एक इन विट्रो तकनीक है जो किसी डीएनए खंड की कई प्रतियाँ बनाने के लिए की जाती है ताकि इसे जेल वैद्युतकणसंचलन के तहत देखा जा सके। पीसीआर का उद्देश्य डीएनए अनुक्रमण या डीएनए माइक्रोएरे में विभिन्न डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए डीएनए की बड़ी संख्या में प्रतियाँ बनाना है। इसके घटकों में डीएनए टेम्प्लेट, प्राइमर, बफर और टैक डीएनए पोलीमरेज़ डीएनटीपी शामिल हैं। पीसीआर के तंत्र को समझने के लिए, उपयोग किए जाने वाले घटकों के महत्व और सिद्धांत को समझना आवश्यक है। डीएनटीपी पीसीआर के प्रमुख घटकों में से एक है। पीसीआर में डीएनटीपी का कार्य टैक डीएनए पोलीमरेज़ की मदद से बढ़ते डीएनए स्ट्रैंड को बढ़ाना और हाइड्रोजन बॉन्डिंग के माध्यम से पूरक डीएनए स्ट्रैंड के साथ संयोजन करना है।

पीसीआर की प्रक्रिया को तापमान पर निर्भर तीन चरणों में विभाजित किया जाता है: विकृतीकरण, एनीलिंग और विस्तार। विकृतीकरण चरण के दौरान, डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए को सिंगल-स्ट्रैंडेड डीएनए में विकृत किया जाता है। एनीलिंग चरण के दौरान, प्राइमर अपने पूरक अनुक्रम के सटीक स्थान पर बंधते हैं, और विस्तार चरण के दौरान, टैक डीएनए पॉलीमरेज़ बढ़ते डीएनए स्ट्रैंड में डीएनटीपी जोड़ता है। एक बार जब स्ट्रैंड खुल जाते हैं और प्राइमर सिंगल-स्ट्रैंडेड डीएनए से बंध जाते हैं, तो टैक डीएनए पॉलीमरेज़ अपनी उत्प्रेरक गतिविधि शुरू कर देता है। अगले चरण में, डीएनटीपी का जोड़ शुरू होता है, जो सटीक पूरक न्यूक्लियोटाइड मौजूद होने पर कम आत्मीयता के साथ पी-डीएनए कॉम्प्लेक्स से जुड़ता है। टैक डीएनए पॉलीमरेज़ के होल्ड होने के तुरंत बाद, पूरक बेस और डीएनटीपी के बीच हाइड्रोजन बॉन्डिंग इंटरैक्शन होता है। यहां यह शुरुआत में पूरा न्यूक्लियोटाइड नहीं है, बल्कि डीएनटीपी पर बेस (नाइट्रोजन बेस) है जो तय करता है कि बंधना है या नहीं।सबसे पहले, यदि यह टेम्पलेट ssDNA पर एक पूरक आधार (T के लिए A, C के लिए G) पाता है, तो यह उनके बीच एक हाइड्रोजन बंधन बनाएगा। C और G के बीच तीन हाइड्रोजन बंधन और A और T के बीच दो हाइड्रोजन बंधन बनते हैं। एक बार हाइड्रोजन बंधन बन जाने पर, Taq DNA पोलीमरेज़ एक फॉस्फोडाइस्टर बंधन बनाकर बढ़ते हुए DNA स्ट्रैंड में dNTP को शामिल करने का अनुपालन करता है। अब फॉस्फोडाइस्टर बंधन बनने के बाद, Taq DNA पोलीमरेज़ नए dNTPs को जोड़ने में एक कदम आगे जाता है। प्राइमर के 3'OH और dNTP के 5'P के बीच एक फॉस्फोडाइस्टर बंधन बनता है। हाइड्रोजन बंधन के बाद, Taq DNA पोलीमरेज़ dNTPs के ट्राइफॉस्फेट से गामा और बीटा-फॉस्फेट को हटाकर प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करता है लेकिन पीसीआर प्रतिक्रियाओं में डीएनटीपी और टैक पॉलीमरेज़ इंटरैक्शन की सटीक गतिकी अज्ञात बनी हुई है।

इन चार न्यूक्लियोटाइड को आमतौर पर इष्टतम बेस समावेशन के लिए समान मात्रा में पीसीआर प्रतिक्रिया में जोड़ा जाता है। हालांकि, पीसीआर द्वारा यादृच्छिक उत्परिवर्तन जैसी कुछ स्थितियों में, असंतुलित डीएनटीपी सांद्रता जानबूझकर एक गैर-प्रूफरीडिंग डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा गलत समावेशन की उच्च डिग्री को बढ़ावा देने के लिए आपूर्ति की जाती है। न्यूनतम डीएनटीपी सांद्रता निर्धारित करने वाला कारक डीएनए की लंबाई और लक्ष्य अनुक्रम की संरचना है। पीसीआर प्रतिक्रिया में, डीएनटीपी आम तौर पर 50-200 μmol/L होता है। जब अंतिम डीएनटीपी सांद्रता 50 mmol/L से अधिक होती है, तो यह Taq डीएनए पोलीमरेज़ की गतिविधि को बाधित कर सकती है। एक डीएनटीपी की कमी के कारण प्रवर्धन के दौरान गलत समावेशन को कम करने के लिए चार डीएनटीपी की सांद्रता बराबर होनी चाहिए।

सामान्य पीसीआर अनुप्रयोगों में, प्रत्येक डीएनटीपी की अनुशंसित अंतिम सांद्रता आमतौर पर 0.2 एमएम होती है। कुछ मामलों में उच्च सांद्रता सहायक हो सकती है, खासकर एमजी की उच्च सांद्रता की उपस्थिति में²⁺, एमजी के रूप में²⁺ डीएनटीपी से बंधता है और उनके समावेश की दर को कम करता है, जिससे गैर-विशिष्ट दर बढ़ जाती है। डीएनटीपी में फॉस्फेट होता है, जो एमजी के साथ संयोजित हो सकता है²⁺ मुक्त Mg की सांद्रता को कम करने के लिए²⁺, इसलिए इसकी सांद्रता में परिवर्तन Mg की प्रभावी सांद्रता को प्रभावित करेगा²⁺उच्च सांद्रता डीएनए और डीएनटीपी स्थितियों के तहत, एमजी²⁺ सांद्रता को तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। साथ ही, dNTPs की कमी से अपूर्ण PCR उत्पाद बनते हैं। हालाँकि, इष्टतम सांद्रता से अधिक dNTPs PCR को बाधित कर सकते हैं। डीएनए पॉलीमरेज़ द्वारा कुशल समावेश के लिए, मुक्त dNTPs को प्रतिक्रिया में 0.01-0.015 mM से कम की सांद्रता में मौजूद होना चाहिए।

3. उच्च शुद्धता वाले dNTP के आवश्यक गुण क्या हैं?

अपनी खोज के बाद से, पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन आणविक आनुवंशिक अनुसंधान में इस्तेमाल किया जाने वाला बेजोड़ उपकरण है। dNTP को बढ़ते डीएनए स्ट्रैंड का विस्तार करने के लिए पीसीआर में नियोजित किया जाता है। भले ही सिस्टम में dNTP की गुणवत्ता खराब हो, लेकिन इसका अंतिम उत्पाद गुणों पर नकारात्मक प्रभाव पड़ेगा। येसेन का उच्च शुद्धता वाला dNTP सभी प्रकार के अत्यधिक संवेदनशील और पुनरुत्पादनीय डीएनए संश्लेषण अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है।

येसेन तैयार-से-उपयोग जीएमपी-ग्रेड न्यूक्लियोटाइड, सेट और मिक्स प्रदान करता है, जो पीएच 7.0 पर शुद्ध पानी में सोडियम लवण के रूप में आपूर्ति किए जाते हैं। विनिर्माण प्रक्रिया अशुद्धियों और पीसीआर-विशिष्ट अवरोधकों को समाप्त करती है, और डीएनटीपी विशेष रूप से आणविक जीव विज्ञान अनुप्रयोगों के लिए निर्मित होते हैं। डीएनटीपी को प्रारंभिक एचपीएलसी के साथ शुद्ध किया जाता है और इसमें कम से कम 99% शुद्धता होती है। उनका उपयोग पीसीआर, आरटी-क्यूपीसीआर, एलएएमपी, डीएनए लेबलिंग और डीएनए अनुक्रमण प्रक्रियाओं में किया जा सकता है।
सख्त नियंत्रण मानक और अत्याधुनिक तकनीक उत्पाद की सर्वोत्तम गुणवत्ता सुनिश्चित करती है। dNTP के प्रत्येक लॉट का विभिन्न अवशेषों (बैक्टीरियल डीएनए, मानव डीएनए, डीएनएज़, आरएनज़, एंडोन्यूक्लिएज़) के लिए परीक्षण किया जाता है।यह उत्पाद एक बैच से दूसरे बैच तक स्थिर है तथा सभी प्रकार के अत्यधिक संवेदनशील और पुनरुत्पादनीय डीएनए संश्लेषण अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है।

4. संबंधित उत्पाद और प्रदर्शन

4.1 कोई जीवाणु डीएनए अवशेष नहीं

चित्र 1. जांच के परिणाम दर्शाते हैं कि dNTPs में कोई जीवाणु जीनोम अवशेष नहीं है।

4.2 कोई मानव डीएनए अवशेष नहीं

चित्र 2. पता लगाने के परिणाम दर्शाते हैं कि dNTPs में कोई मानव जीनोम अवशेष नहीं है।

4.3 कोई DNase, RNase, और एंडोन्यूक्लिऐस संदूषण नहीं

चित्र 3. पता लगाने के परिणाम दर्शाते हैं कि dNTPs में कोई DNase, RNase और एंडोन्यूक्लिऐस नहीं है।

4.4 पीसीआर प्रवर्धन (20 केबी डीएनए)

चित्र 4. पीसीआर प्रवर्धन परिणाम अपेक्षित 20 केबी उत्पाद है।

4.5 उत्पाद जानकारी

येसेन द्वारा उपलब्ध कराए गए उत्पाद इस प्रकार हैं।

तालिका नंबर एक।उत्पाद जानकारी