——अधिक जीनोटाइपिंग, कम समय और कम अभिकर्मक
पीसीआर-आधारित जीनोटाइपिंग और अन्य प्रयोगों में अक्सर नमूनों से जीनोमिक डीएनए के शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है। जब परीक्षण के लिए कई नमूने होते हैं, तो जीनोमिक डीएनए को शुद्ध करने की प्रक्रिया समय लेने वाली, दोहराव वाली और महंगी होती है। येसेन बायोलॉजी ने टैक डीएनए पॉलीमरेज़ को संशोधित करके और पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली को अनुकूलित करके, जीनोमिक शुद्धिकरण की आवश्यकता को समाप्त करके डायरेक्ट पीसीआर किट उत्पादों की एक श्रृंखला विकसित की है।
चतुर पी.सी.आर.: प्रत्यक्ष पी.सी.आर.
येसेन की डायरेक्ट पीसीआर किट सीधे नमूने से शुरू होती है, पीसीआर-आधारित जीनोटाइपिंग (चित्र 1) के लिए टेम्पलेट्स के रूप में जीनोमिक शुद्धिकरण के बिना न्यूनतम मात्रा में कच्चे नमूनों (चित्र 1-ए) या उनके लाइसेट उत्पादों (चित्र 1-बी) का उपयोग करती है। पारंपरिक पीसीआर-आधारित जीनोटाइपिंग की तुलना में, डायरेक्ट पीसीआर किट कम नमूने का उपयोग करती है, इसे संचालित करना आसान है, इसकी प्रयोगात्मक लागत कम है, और उच्च-थ्रूपुट नमूना पहचान की अनुमति देता है।
चित्र 1 प्रत्यक्ष पीसीआर प्रवर्धन वर्कफ़्लो
A. प्रत्यक्ष विधि: नमूने की एक छोटी मात्रा लें और पीसीआर पहचान के लिए इसे सीधे पीसीआर मास्टर मिक्स में जोड़ें।तकनीकी लाभ
प्रत्यक्ष: समय लेने वाली और महंगी डीएनए शुद्धिकरण की कोई आवश्यकता नहीं।
तीव्र: टेम्पलेट तैयार करना 10 मिनट में पूरा हो जाता है, तथा पीसीआर प्रतिक्रिया मात्र 30 मिनट में पूरी हो जाती है।
सरल: नमूनों को काटने या पीसने की आवश्यकता के बिना विखंडित किया जा सकता है, और पीसीआर मिश्रण पूर्व-मिश्रित रूप में होता है, जिससे पाइपिंग चरणों की संख्या कम हो जाती है।
बचत: प्रयुक्त सामग्री की छोटी मात्रा।
उच्च-थ्रूपुट: लिसिस प्रतिक्रियाएं 96-वेल प्लेट में पूरी की जा सकती हैं।
अवरोध-प्रतिरोधी: विभिन्न पशु और पौधों के नमूनों के प्रति सहनशील।
प्रत्यक्ष पीसीआर किट प्रायोगिक प्रक्रिया
उत्पादों की यह श्रृंखला नमूनों को नष्ट करने के लिए एक अद्वितीय प्रोटीज लाइसिस प्रणाली का उपयोग करती है। लाइसिस समाधान को सीधे टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और जीन प्रवर्धन के लिए किट में दिए गए पीसीआर मास्टर मिक्स के साथ जोड़ा जा सकता है।
चित्र 2 माउस ऊतकों की प्रत्यक्ष पीसीआर प्रयोग प्रक्रिया
अंजीर।3 पादप ऊतक पर प्रत्यक्ष पीसीआर प्रयोग की प्रक्रिया
प्रत्यक्ष पीसीआर उत्पाद चयन तालिका
| उत्पाद श्रृंखला | माउस डायरेक्ट पीसीआर दूसरी पीढ़ी | |||
| उत्पाद संख्या | 10189ईएस | 10185ईएस | 10188ईएस | 10187ईएस |
| विशेष विवरण | 20 टी/50 टी/200 टी/500 टी | 50 टी/200 टी | 20 टी/50 टी/200 टी/500 टी | 50 टी/200 टी |
| विशेषताएँ | ||||
| एम्प्लीकॉन लंबाई | ≤5 केबी | ≤1 केबी | ≤8 केबी | ≤1 केबी |
| विस्तार समय (s/kb) | 3-20 सेकंड | 30 सेकंड | ≤2 केबी: 3-5 सेकंड ≤8 केबी: 10 सेकंड | 60 सेकंड |
| लागू जीव | चूहे, चूहे | चूहे, चूहे | मनुष्य, चूहे, बकरी, मुर्गियां, सूअर, आदि। | चावल, मक्का, तम्बाकू, रेपसीड, गेहूं, सोयाबीन, आदि। |
| लागू ऊतक/सामग्री प्रकार | चूहे की पूंछ, चूहे का कान, पैर की उंगलियां (मांसपेशियों सहित), और अन्य अंग | चूहे की पूंछ, चूहे का कान, पैर की उंगलियां (मांसपेशियों सहित), और अन्य अंग | ताजा रक्त जिसमें सामान्य थक्कारोधी पदार्थ जैसे EDTA, हेपरिन, साइट्रेट, प्रशीतित (जमे हुए) रक्त, तथा वाणिज्यिक सूखे रक्त धब्बे जैसे Whatman903 शामिल हों® और एफटीए® | कोमल पत्तियाँ, पुरानी पत्तियाँ, पौधे, कोमल तने |
| नमूना उपयोग | ऊतक: 5 मिलीग्राम माउस पूंछ: 1-5 मिमी | ऊतक: 5-10 मिलीग्राम चूहे की पूंछ: 1-5 मिमी | सम्पूर्ण रक्त: 0.5%-20% व्हाटमैन® सूखे खून के धब्बे: 1 मिमी2 | पत्ती: 1-10 मिमी बीज: 1-3 मिमी |
| जीनोमिक रिलीज समय | 5-10 मिनट | 15 मिनट | 0-3 मिनट | 0-10 मिनट |
| उत्पाद अंत संरचना | कुंद अंत | कुंद अंत | कुंद अंत | कुंद अंत |
| एनीलिंग तापमान | टीएम-(2~5)℃ | टीएम-(2~5)℃ | टीएम-(1~2)℃ | टीएम-(2~5)℃ |
| जीसी क्लिपिंग रेंज | 29-70% | 30-70% | 30-75% | 40-65% |
| 5'-3' एक्सोन्यूक्लिऐस गतिविधि | हाँ | हाँ | हाँ | हाँ |
| अनुप्रयोग | ||||
| जीनोटाइपिंग | हाँ | हाँ | हाँ | हाँ |
| मल्टीप्लेक्स पीसीआर | 5x तक |
| 3-4x तक |
|
| प्रत्यक्ष नमूना प्रवर्धन | हाँ | हाँ | हाँ | हाँ |
| अन्य सुविधाओं | ||||
| वैद्युतकणसंचलन सूचक | रंगहीन | नीला | रंगहीन | नीला |
| ठोस शुरुआत | हाँ | हाँ | हाँ | हाँ |
| प्रीमिक्स्ड/किट | किट (मिश्रण के साथ) | किट (मिश्रण के साथ) | किट (मिक्स+बफर के साथ) | किट (मिश्रण के साथ) |
उत्पाद लाभ
संशोधित टैक डीएनए पोलीमरेज़ प्रत्यक्ष पीसीआर की गारंटी है: इसमें अवरोधकों के प्रति अत्यधिक सहनशीलता है।
जब गैर-शुद्ध नमूनों को टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता है, तो पीसीआर प्रतिक्रियाओं को बाधित करने वाले कई घटक पेश किए जाते हैं। साधारण पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणालियों और टैक डीएनए पॉलीमरेज़ के साथ आदर्श परिणाम प्राप्त करना मुश्किल है, या पीसीआर प्रवर्धन करना असंभव भी है। किट की इस श्रृंखला में पीसीआर मिक्स एक सूत्र-अनुकूलित प्रीमिक्स है, जिसमें संशोधित टैक डीएनए पॉलीमरेज़ का उपयोग किया जाता है, जो टेम्पलेट डीएनए से बंधन क्षमता को बढ़ाता है और आम पीसीआर अवरोधकों के प्रति उच्च सहनशीलता रखता है, इस प्रकार एक व्यापक टेम्पलेट अनुकूलनशीलता है।
चित्र 4 प्रत्यक्ष पीसीआर किट में पीसीआर मिश्रण में अशुद्धियों के प्रति उच्च सहनशीलता होती है। अलग-अलग पीसीआर मिक्स के साथ पीसीआर के लिए समान मात्रा में टेम्पलेट का उपयोग किया जाता है, और सिस्टम में पीसीआर प्रतिक्रिया अवरोधकों की विभिन्न सांद्रताएँ जोड़ी जाती हैं। विभिन्न स्थितियों के तहत पीसीआर उत्पादों की मात्रा की तुलना की जाती है।
यईसेन विभिन्न नमूनों के लिए उत्पादों की एक श्रृंखला विकसित की है:
- I. कृंतक-विशिष्ट प्रकार: माउस टिशू डायरेक्ट पीसीआर किट प्लस (10189ES)
लागू नमूने: चूहे के ऊतक (जैसे चूहे की पूंछ, चूहे का कान, चूहे का पंजा, आदि)
- उच्च प्रवर्धन दक्षता (लंबाई, गति, GC अनुकूलता)
चित्र 5 माउस टिशू डायरेक्ट पीसीआर किट प्लस विभिन्न ऊतकों से लाइसेट्स को बढ़ाता है। 1: प्लास्मिड; 2: माउस कान; 3: माउस टेल; 4: लिवर। लाइसिस की स्थिति: 10 मिनट के लिए 70°C लाइसिस, 5 मिनट के लिए 95°C निष्क्रियता। लक्ष्य टुकड़े 1 हैं केबी, 2 केबी, 3 केबी, और 6 केबी, विस्तार समय क्रमशः 3, 5, 10, और 20 सेकंड/केबी पर सेट किया गया है। एम: 10510ES60 (येसेन).
- व्यापक टेम्पलेट संगतता (10189ES)
चित्र 6 माउस टिशू डायरेक्ट पीसीआर किट प्लस का उपयोग मानव 293 कोशिकाओं को सीधे नष्ट करने (10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस) और बढ़ाने के लिए किया गया था (1), लार (2), और खोपड़ी ऊतक (3). सभी नमूनों में स्पष्ट लक्ष्य बैंड, M: 10510ES60 (YEASEN) दिखा।
- II. मल्टी-स्पेसीज ब्लड यूनिवर्सल टाइप: ब्लड एडवांस्ड डायरेक्ट पीसीआर किट (10188ES)
- प्रवर्धन लंबाई 8 केबी तक
चित्र 7 में अलग-अलग लंबाई के डीएनए टुकड़ों को सीधे मानव के पूरे रक्त से ब्लड एडवांस्ड डायरेक्ट पीसीआर किट का उपयोग करके प्रवर्धित किया गया। रक्त के नमूनों को -20 डिग्री सेल्सियस पर EDTA के साथ एंटीकोगुलेंट के रूप में संग्रहीत किया गया था। रक्त टेम्पलेट सांद्रता 10% थी, और विस्तार समय 10 सेकंड/केबी पर सेट किया गया था। एम: 10510ES60 (YEASEN)।
- उच्च सहनशीलता
चित्र 8 ए: ब्लड एडवांस्ड डायरेक्ट पीसीआर किट का उपयोग मानव EDTA एंटीकोएग्युलेटेड पूरे रक्त से सीधे 71% की GC सामग्री वाले 2 kb DNA खंड को बढ़ाने के लिए किया जाता है। रक्त टेम्पलेट सांद्रता 0.5-50% से ग्रेडिएंट-सेट है, और विस्तार समय 10 सेकंड/केबी पर सेट है। बी: ब्लड एडवांस्ड डायरेक्ट पीसीआर किट का उपयोग माउस EDTA एंटीकोएग्युलेटेड पूरे रक्त से सीधे 67% की GC सामग्री के साथ 2.2 kb DNA खंड को बढ़ाने के लिए किया जाता है। रक्त टेम्पलेट सांद्रता 0.5-50% से सेट की जाती है, और विस्तार समय 10 सेकंड / kb है। M: 10510ES60 (YEASEN)।
- III. पादप-विशिष्ट प्रकार: पादप ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट (10187ES)
- कई प्रकार के पौधों के नमूनों से सत्यापित
चित्र 9 विभिन्न प्रकार के पौधों के पत्ती ऊतकों से प्रत्यक्ष प्रवर्धन परिणाम। एम: 100 बीपी डीएनए सीढ़ी। सी: टेम्पलेट के रूप में संबंधित पौधों से शुद्ध जीनोमिक डीएनए। 1-2: टेम्पलेट के रूप में पत्ती ऊतक लाइसेट। चक्रों की संख्या: 30 चक्र।
ग्राहक मामला
- I. माउस जीनोटाइप पहचान
गुआंगज़ौ में एक जैविक कंपनी:
चित्र 10 माउस डायरेक्ट पीसीआर किट (10189ES) का उपयोग करके माउस की पूंछ का प्रवर्धन। लक्ष्य जीन: 500 बीपी; लाइसिस समय: 10 मिनट; पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली: 25 μL, विस्तार समय: 5 सेकंड/केबी।
- द्वितीय.चावल जीन प्रत्यक्ष प्रवर्धन
एक्सएक्स विश्वविद्यालय
चित्र 11 प्लांट डायरेक्ट पीसीआर किट (10187ES) का उपयोग चावल से संबंधित जीन को बढ़ाने के लिए किया जाता है।
आरउत्तेजित पीउत्पादों
| उत्पाद स्थिति | प्रोडक्ट का नाम | उत्पाद संख्या | उत्पाद विशिष्टता |
| उच्च गुणवत्ता वाला एगरोज़ | 10208ईएस60/76 | 100 ग्राम/500 ग्राम | |
| न्यूक्लिक एसिड दाग (यूवी प्रकाश के तहत) | 10202ES76 | 500 μएल | |
| रैपिड पीसीआर अपग्रेड, कॉलोनी पीसीआर हो सकता है और जटिल टेम्पलेट प्रवर्धन के लिए उपयुक्त है | 10167ईएस03/08 | 1 एमएल/5×1 एमएल |