फ्लोरोसेंट क्वांटिटेटिव पीसीआर में सीटी वैल्यू एक महत्वपूर्ण परिणाम प्रतिनिधित्व है। इसका उपयोग जीन अभिव्यक्ति स्तरों या जीन कॉपी संख्याओं में अंतर की गणना करने के लिए किया जाता है। तो, फ्लोरोसेंट क्वांटिटेशन में सीटी वैल्यू की किस सीमा को उचित माना जा सकता है? हम यह कैसे सुनिश्चित कर सकते हैं कि सीटी वैल्यू एक प्रभावी सीमा के भीतर आती है? आज, आइए जिओ यी को सभी के लिए इस प्रश्न का उत्तर देने दें।
सीटी वैल्यू क्या है?
क्यूपीसीआर प्रवर्धन प्रक्रिया में, सीटी मान प्रवर्धन चक्रों (चक्र सीमा) की संख्या को संदर्भित करता है जिस पर प्रवर्धित उत्पाद का प्रतिदीप्ति संकेत निर्धारित प्रतिदीप्ति सीमा तक पहुँचता है। "सी" का अर्थ है चक्र, और "टी" का अर्थ है सीमा। सरल शब्दों में, सीटी मान चक्रों की वह संख्या है जो क्यूपीसीआर में प्रारंभिक टेम्पलेट को उत्पाद की एक निश्चित मात्रा तक पहुँचने में लगती है, जिसे बाद में और अधिक विस्तार से समझाया जाएगा।
सीटी मान का कार्य क्या है?
1. घातीय प्रवर्धन, टेम्पलेट मात्रा और सीटी मान के बीच संबंध
आदर्श परिदृश्य में, qPCR के दौरान, जीन घातीय रूप से प्रवर्धित होते हैं और एक निश्चित संख्या में चक्रों में संचित होते हैं। प्रवर्धन चक्रों की संख्या और उत्पाद की मात्रा के बीच संबंध को इस प्रकार व्यक्त किया जा सकता है: प्रवर्धित उत्पाद की मात्रा = प्रारंभिक टेम्पलेट मात्रा×(1 + En)^चक्रों की संख्या। हालाँकि, qPCR प्रतिक्रियाएँ हमेशा आदर्श परिस्थितियों में नहीं होती हैं। जब प्रवर्धित उत्पाद की मात्रा "निश्चित उत्पाद मात्रा" तक पहुँच जाती है, तो इस बिंदु पर चक्रों की संख्या Ct मान होती है, जो घातीय प्रवर्धन की अवधि को दर्शाती है। Ct मान और प्रारंभिक टेम्पलेट मात्रा के बीच संबंध इस प्रकार है: टेम्पलेट के Ct मान और उस टेम्पलेट की प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या के लघुगणक के बीच एक रैखिक संबंध होता है। प्रारंभिक टेम्पलेट की उच्च सांद्रता के परिणामस्वरूप Ct मान कम होता है, जबकि प्रारंभिक टेम्पलेट की कम सांद्रता के परिणामस्वरूप Ct मान अधिक होता है।
2.प्रवर्धन वक्र, प्रतिदीप्ति सीमा, और एक निश्चित उत्पाद मात्रा
क्यूपीसीआर प्रवर्धन उत्पादों की मात्रा को सीधे प्रतिदीप्ति संकेतों के रूप में दर्शाया जाता है, जिसे प्रवर्धन वक्र के रूप में जाना जाता है। पीसीआर के शुरुआती चरणों में, जब प्रवर्धन आदर्श परिस्थितियों में होता है और चक्रों की संख्या कम होती है, तो उत्पादों का संचय न्यूनतम होता है, और उत्पादित प्रतिदीप्ति का स्तर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति शोर से काफी अलग नहीं होता है। इसके बाद, प्रतिदीप्ति का उत्पादन घातीय चरण में प्रवेश करता है। पीसीआर उत्पाद की मात्रा का पता एक निश्चित बिंदु पर लगाया जा सकता है जब प्रतिक्रिया सिर्फ घातीय चरण में प्रवेश कर रही होती है, जिसे "निश्चित उत्पाद मात्रा" कहा जाता है। इसका उपयोग टेम्पलेट की प्रारंभिक सामग्री का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। इसलिए, निश्चित उत्पाद मात्रा के अनुरूप प्रतिदीप्ति संकेत तीव्रता को प्रतिदीप्ति सीमा के रूप में जाना जाता है।
पीसीआर के बाद के चरणों में, प्रवर्धन वक्र अब घातीय प्रवर्धन प्रदर्शित नहीं करता है तथा रैखिक चरण और पठार चरण में प्रवेश करता है।
3.सीटी मानों की पुनरुत्पादकता
जब पीसीआर चक्र उन चक्रों की संख्या तक पहुँच जाता है जिस पर सीटी मान होता है, तो यह सही घातीय प्रवर्धन चरण में प्रवेश कर रहा होता है। इस बिंदु पर, छोटी त्रुटियों को प्रवर्धित नहीं किया गया है, इसलिए सीटी मानों की पुनरुत्पादकता उत्कृष्ट है। इसका मतलब यह है कि चाहे एक ही टेम्पलेट को अलग-अलग समय पर या एक ही समय में अलग-अलग ट्यूबों में प्रवर्धित किया जाए, प्राप्त सीटी मान स्थिर रहते हैं।
Ct मान की सीमा क्या है?
1.प्रवर्धन दक्षता एन
पीसीआर प्रवर्धन दक्षता से तात्पर्य उस दक्षता से है जिसके साथ पॉलीमरेज़ लक्ष्य जीन को प्रवर्धन उत्पादों में परिवर्तित करता है।जब एक डीएनए अणु को दो डीएनए अणुओं में परिवर्तित किया जाता है तो प्रवर्धन दक्षता 100% होती है। प्रवर्धन दक्षता को आमतौर पर एन के रूप में दर्शाया जाता है। आगे के लेखों में विश्लेषण की सुविधा के लिए, यहाँ प्रवर्धन दक्षता को प्रभावित करने वाले कारकों का संक्षिप्त परिचय दिया गया है।
| प्रभावित करने वाले कारक | स्पष्टीकरण | निर्णय |
| ए. पीसीआर अवरोधक | 1. टेम्पलेट आरएनए में ऐसे पदार्थ हो सकते हैं जो पीसीआर प्रतिक्रिया को बाधित करते हैं, जैसे प्रोटीन या डिटर्जेंट आदि। 2. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बाद प्राप्त सीडीएनए में टेम्पलेट आरएनए और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन अभिकर्मकों के घटकों की उच्च सांद्रता हो सकती है, जो बाद के पीसीआर को भी बाधित कर सकती है। | 1. संदूषण की उपस्थिति का आकलन A260/A280 और A260/A230 अनुपातों को मापकर या RNA वैद्युतकणसंचलन करके किया जा सकता है। 2. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बाद, क्या सीडीएनए एक निश्चित अनुपात में पतला हो गया है। |
| बी. अनुचित प्राइमर डिजाइन | प्राइमर प्रभावी रूप से तापानुशीतन नहीं कर सकता। | जांचें कि प्राइमर में डिमर या हेयरपिन संरचनाएं हैं या नहीं, और यदि कोई विसंगतियां हैं; तो कभी-कभी डिजाइन स्पैनिंग इंट्रॉन पर ध्यान देना आवश्यक होता है। |
| C.अनुपयुक्त प्रतिक्रिया प्रक्रिया | 1. प्राइमर प्रभावी रूप से तापानुशीतित नहीं हो सकते। 2. डीएनए पॉलीमरेज़ की गतिविधि पूरी तरह से जारी नहीं होती है। 3. लंबे समय तक उच्च तापमान के कारण डीएनए पॉलीमरेज़ की गतिविधि कम हो जाती है। | 1. एनीलिंग तापमान प्राइमर के Tm मान से अधिक है। 2. पूर्व-विकृतीकरण समय बहुत कम है। 3. प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल में प्रत्येक चरण की अवधि बहुत लंबी है। |
| डी. अभिकर्मकों का अच्छी तरह से मिश्रण न होना या पाइपिंग में त्रुटियाँ | प्रतिक्रिया प्रणाली में, पीसीआर प्रतिक्रिया घटकों की स्थानीय सांद्रता बहुत अधिक या असमान होती है, जिसके परिणामस्वरूप पीसीआर का गैर-घातीय प्रवर्धन होता है। | / |
| ई.एम्प्लिकॉन लंबाई | एम्प्लीकॉन की लंबाई बहुत अधिक है, जो 300 बेस पेयर से अधिक है, जिसके परिणामस्वरूप प्रवर्धन दक्षता कम है। | जाँच करें कि एम्प्लीकॉन की लम्बाई 80 बेस पेयर और 300 बेस पेयर के बीच है या नहीं। |
| एफ.qPCR अभिकर्मकों का प्रभाव | अभिकर्मकों में डीएनए पॉलीमरेज़ की कम सांद्रता या बफर में उप-इष्टतम आयन सांद्रता के परिणामस्वरूप टैक एंजाइम अपनी अधिकतम सक्रियता तक नहीं पहुंच पाता है। | मानक वक्र का उपयोग प्राइमरों की प्रवर्धन दक्षता को मापने के लिए किया जाता है। |
2.सीटी मान की सीमा
सीटी मानों की सीमा 15-35 है। 15 से कम सीटी मान को बेसलाइन चरण के भीतर माना जाता है और यह फ्लोरोसेंस सीमा तक नहीं पहुंचा है। आदर्श रूप से, सीटी मान और टेम्पलेट की प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या के लघुगणक के बीच एक रैखिक संबंध होता है, जिसे मानक वक्र के रूप में जाना जाता है। मानक वक्र का उपयोग करते हुए, जब प्रवर्धन दक्षता 100% होती है, तो जीन की एकल प्रतिलिपि को मापने के लिए सीटी मान की गणना लगभग 35 के रूप में की जाती है। यदि सीटी मान 35 से अधिक है, तो सैद्धांतिक रूप से, टेम्पलेट की प्रारंभिक प्रतिलिपि संख्या 1 से कम है, जिसे सांख्यिकीय रूप से महत्वहीन माना जा सकता है।
विभिन्न जीनों के लिए, Ct मान सीमा, जीन प्रतियों की प्रारंभिक टेम्पलेट मात्रा और प्रवर्धन दक्षता में भिन्नता के कारण, जीन की रैखिक पहचान सीमा की गणना करने के लिए उस जीन के लिए एक मानक वक्र के निर्माण की आवश्यकता होती है।
3.सीटी मान को प्रभावित करने वाले कारक
जैसा कि प्रवर्धन चक्रों की संख्या और उत्पाद की मात्रा के बीच संबंध द्वारा दर्शाया गया है: प्रवर्धन उत्पाद राशि = प्रारंभिक टेम्पलेट राशि × (1 + En)^चक्रों की संख्या, यह देखा जा सकता है कि आदर्श परिस्थितियों में, प्रारंभिक टेम्पलेट राशि और En Ct मान को प्रभावित करेंगे। टेम्पलेट गुणवत्ता या प्रवर्धन दक्षता में अंतर के कारण Ct मान बहुत अधिक या बहुत कम हो सकता है।
4. सीटी मान बहुत अधिक या बहुत कम होना
जिओ यी ने हमारी कंपनी के तकनीकी विभाग के विशेषज्ञों से परामर्श किया और हमारे पाठकों को जानकारी देने के लिए सीटी मान के साथ दो सामान्य प्रकार के मुद्दों के कारणों और समाधानों का सारांश दिया।
| संकट | कारण | समाधान |
| सीटी मान बहुत अधिक है | टेम्पलेट सांद्रता कम है या पीसीआर अवरोधक मौजूद हैं। प्रवर्धन दक्षता कम है. | 1. टेम्पलेट की सांद्रता बढ़ाएँ; या आरएनए या सीडीएनए का तनुकरण अनुपात बढ़ाएँ; या टेम्पलेट को पुनः तैयार करें। 2. एनीलिंग तापमान को कम करें, या दो-चरणीय प्रवर्धन विधि का उपयोग करें; सुनिश्चित करें कि घटक और प्रणाली पूरी तरह मिश्रित हैं; प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल को अनुकूलित करें; या अभिकर्मकों को बदलने का प्रयास करें। |
| सीटी मान बहुत कम है | 1. उच्च टेम्पलेट सांद्रता 2. एनटीसी (नो टेम्पलेट कंट्रोल) और एनआरसी (नो रिवर्स कंट्रोल) में संदूषण 3. अनुपयुक्त प्राइमर डिज़ाइन | 1. टेम्पलेट आरएनए की मात्रा कम करें; या सीडीएनए को उच्च अनुपात में पतला करें। 2. सभी अभिकर्मकों को नए सिरे से बदलें; या UDGase संदूषण-रोधी अभिकर्मकों का उपयोग करें। 3. गैर-विशिष्ट प्रवर्धन से बचने के लिए प्रक्रिया को अनुकूलित करें। |
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| प्रोडक्ट का नाम | बिल्ली# | आकार |
| Hieff UNICON™ यूनिवर्सल ब्लू qPCR SYBR ग्रीन मास्टर मिक्स | 11184ES08 | 5×1 एमएल |
| हाईफ़ेयर™ Ⅲ qPCR के लिए प्रथम स्ट्रैंड cDNA संश्लेषण सुपरमिक्स (gDNA डाइजेस्टर प्लस) | 11141ES60 | 100 टी |
| qPCR के लिए हाईफ़ेयर™ एडवांसफ़ास्ट वन-स्टेप RT-gDNA डाइजेस्टियन सुपरमिक्स | 11151ES60 | 100 टी |
| हाईफ़ेयर™ एडवांसफ़ास्ट 1 स्ट्रैंड cDNA सिंथेसिस किट (कोई डाई नहीं) | 11150ईएस60 | 100 टी |