फ्लोरोसेंट क्वांटिटेटिव पीसीआर (qPCR) प्रयोगशालाओं में आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है, जिसे जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, जीनोटाइपिंग, रोगज़नक़ का पता लगाने, एसएनपी विश्लेषण और बहुत कुछ में लागू किया जा सकता है। qPCR का संचालन सरल है, और इसके सिद्धांत को समझना आसान है। अब, अव्यवस्थित डेटा के ढेर का सामना करते हुए, परिणामों का विश्लेषण कैसे किया जाए, यह एक कठिन काम बन जाता है। आज, जिओ यी आपको जटिल प्रक्रियाओं को सरल बनाने और आसानी से डेटा प्राप्त करने के तरीके के बारे में मार्गदर्शन करेंगे जिसे SCI पत्रिकाओं में प्रकाशित किया जा सकता है!
क्यूपीसीआर में इस्तेमाल की जाने वाली आम विश्लेषण विधियों में सापेक्ष परिमाणीकरण और निरपेक्ष परिमाणीकरण शामिल हैं, और इन विधियों के बीच चुनाव अलग-अलग प्रयोगात्मक डिज़ाइनों पर आधारित होना चाहिए। इस अंक में, हम क्यूपीसीआर के एक आम अनुप्रयोग पर ध्यान केंद्रित करेंगे—जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण, जहाँ सापेक्ष परिमाणीकरण विधि को आम तौर पर चुना जाता है।
प्रयोगात्मक परिरूप
मान लीजिए कि हमें वर्तमान में अरेबिडोप्सिस AtSUC2 जीन की अभिव्यक्ति पर प्रकाश प्रेरण के प्रभाव का अध्ययन करने की आवश्यकता है। नियंत्रण समूह में अरेबिडोप्सिस पौधे शामिल होंगे, जिनका कोई उपचार नहीं हुआ है, जबकि प्रायोगिक समूह में ऐसे पौधे होंगे, जिनका एक निश्चित प्रकाश प्रेरण के साथ उपचार किया गया है। दोनों समूहों से आरएनए निकाला जाएगा और सीडीएनए प्राप्त करने के लिए रिवर्स-ट्रांसक्रिप्ट किया जाएगा, जिसे फिर एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। अरेबिडोप्सिस GAPDH जीन को qPCR प्रयोग के लिए एक आंतरिक संदर्भ के रूप में चुना जाएगा।
जिन qPCR कुओं को स्थापित करने की आवश्यकता है वे इस प्रकार हैं:
1) एनटीसी (नो टेम्पलेट कंट्रोल) का उपयोग यह सत्यापित करने के लिए किया जाता है कि पीसीआर प्रणाली में कोई संदूषण है या नहीं।
2) एनआरटी (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन नहीं) से तात्पर्य ऐसे आरएनए का उपयोग करना है जिसका रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन नहीं हुआ है, जो कि जीडीएनए संदूषण के लिए नियंत्रण का काम करता है।
3) द आंतरिक संदर्भ जीन इसका उपयोग नमूनों की प्रारंभिक सांद्रता में परिवर्तन के कारण उत्पन्न अंतर को ठीक करने के लिए किया जाता है।
4) का चयन नियंत्रण नमूने आम तौर पर निम्नलिखित श्रेणियों में आता है:
- जीन अभिव्यक्ति पर किसी निश्चित उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए, अनुपचारित नमूने को संदर्भ नमूने के रूप में उपयोग किया जाता है।
- विभिन्न समयों पर जीन अभिव्यक्ति में अंतर का पता लगाने के लिए, समय 0 पर नमूने को संदर्भ नमूने के रूप में उपयोग किया जाता है।
- विभिन्न ऊतकों के बीच जीन अभिव्यक्ति में अंतर की तुलना करने के लिए, एक ऊतक को संदर्भ नमूने के रूप में मनमाने ढंग से चुना जाता है।
यहाँ ध्यान देने वाली एक बात यह है कि ऊपर बताई गई प्रत्येक सामग्री के लिए, 3 पीसीआर कुएँ (1, 2, 3) स्थापित किए गए हैं। ये पीसीआर डुप्लिकेट हैं, जिन्हें तकनीकी प्रतिकृति के रूप में भी जाना जाता है, जिनका उद्देश्य परिचालन संबंधी त्रुटियों को खत्म करना और प्रवर्धन दक्षता का सटीक मूल्यांकन करना है। इसके अतिरिक्त, जैविक प्रतिकृतियाँ स्थापित करने की आवश्यकता है, जिसमें जैविक परिवर्तनशीलता को जांचने और यह विश्लेषण करने के लिए कि क्या उपचार का सांख्यिकीय महत्व है, विभिन्न सामग्रियों (विभिन्न समय, पौधे, बैच, प्रतिक्रिया प्लेट) पर एक ही प्रयोग करना शामिल है। विशेष रूप से इस मामले में, प्रायोगिक समूह और नियंत्रण समूह दोनों को संसाधित किए जाने वाले एराबिडोप्सिस नमूनों (ए, बी, सी) के कम से कम दो और सेट की आवश्यकता होती है। प्रत्येक सेट से आरएनए निकाला जाता है और रिवर्स-ट्रांसक्रिप्ट किया जाता है, उसके बाद क्यूपीसीआर किया जाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, तीन जैविक प्रतिकृतियों का औसत उपयोग किया जाता है।
परिणाम विश्लेषण — ΔΔCt विधि
ΔΔCt विधि की विशेषता यह है कि यह गणना के लिए पूरी तरह से Ct मानों पर निर्भर करती है, लेकिन आधार यह है कि लक्ष्य जीन और संदर्भ जीन की प्रवर्धन दक्षता अपेक्षाकृत सुसंगत होनी चाहिए और दोनों 90-110% की सीमा के भीतर होनी चाहिए।
विशिष्ट गणना सूत्र इस प्रकार है:
ΔCt = Ct (लक्ष्य जीन) - Ct (संदर्भ जीन)
ΔΔCt = ΔCt (प्रायोगिक समूह) - ΔCt (नियंत्रण समूह)
आरक्यू = 2^(-ΔΔCt)
उपरोक्त प्रयोग को एराबिडोप्सिस AtSUC2 जीन की अभिव्यक्ति पर प्रकाश प्रेरण के प्रभाव का अध्ययन मानते हुए, qPCR के परिणाम निम्नानुसार हैं:
गणना के दौरान, हम सबसे पहले नियंत्रण समूह के लिए 2^-△Ct डेटा का औसत निकालते हैं (जैसा कि ऊपर दिए गए चित्र में दिखाया गया है, जो 0.00116 है)। फिर, हम 2^-△Ct के प्रत्येक मान को इस औसत से विभाजित करके 2^-△△Ct का मान प्राप्त करते हैं। अंत में, हम इन मानों को औसत और मानक विचलन प्राप्त करने के लिए व्यवस्थित करते हैं, जो दर्शाता है कि प्रायोगिक समूह में लक्ष्य जीन का अभिव्यक्ति स्तर नियंत्रण समूह की तुलना में लगभग 9.73 गुना बढ़ गया है।
परिणाम ग्राफपैड सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निम्नानुसार प्लॉट किए गए हैं:
सॉफ्टवेयर के टी-टेस्ट का उपयोग करके गणना किया गया P मान 0.0024 है, जो 0.05 से कम है, जो सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दर्शाता है और परिणाम विश्वसनीय हैं।
परिणाम विश्लेषण - दोहरी मानक वक्र विधि
व्यावहारिक अनुप्रयोगों में, चूंकि लक्ष्य जीन और संदर्भ जीन की प्रवर्धन दक्षता अक्सर भिन्न होती है, इसलिए समान प्रवर्धन दक्षता प्राप्त करने के लिए प्राइमर को फिर से डिज़ाइन करना और प्रतिक्रिया स्थितियों को अनुकूलित करना आवश्यक है। हालाँकि, हम एक अधिक सुविधाजनक विधि, दोहरे मानक वक्र दृष्टिकोण भी चुन सकते हैं।
यहाँ, आइए सबसे पहले निरपेक्ष परिमाणीकरण की विश्लेषण विधि को समझें। विशिष्ट चरण पीसीआर के माध्यम से लक्ष्य खंड को बढ़ाना है, फिर लक्ष्य खंड को क्लोनिंग वेक्टर में डालना, पुनः संयोजक प्लास्मिड को निकालना, और अनुक्रमण की पुष्टि के बाद यह सही है, इसे एक मानक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। प्लास्मिड डीएनए की मात्रा को नैनोड्रॉप जैसे उपकरणों का उपयोग करके मापा जा सकता है, और प्रतिलिपि संख्या रूपांतरण सूत्र का उपयोग करके प्रतिलिपि संख्या को विशिष्ट प्लास्मिड प्रतियों में परिवर्तित किया जाता है। उसके बाद, कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला के बाद डीएनए को बढ़ाया जाता है। मानक प्रतिलिपि संख्या के लघुगणक को x-अक्ष और मापे गए Ct मानों को y-अक्ष के रूप में मानक वक्र के साथ प्लॉट किया जाता है। अज्ञात नमूने के Ct मान के आधार पर, इसकी निरपेक्ष प्रतिलिपि संख्या की गणना की जा सकती है।
प्रतिलिपि संख्या गणना सूत्र:
प्रतिलिपि संख्या = (द्रव्यमान ÷ सापेक्ष आणविक द्रव्यमान) × 6.02 × 10^23
दोहरे मानक वक्र विधि में लक्ष्य जीन और संदर्भ जीन के लिए अलग-अलग मानक नमूने बनाना, पूर्ण परिमाणीकरण करना और मानक वक्र बनाना शामिल है। अज्ञात नमूनों की पूर्ण प्रतिलिपि संख्या की गणना करने के बाद, तुलना की जाती है, जिससे उच्च सटीकता मिलती है।
विशिष्ट गणना सूत्र इस प्रकार है:
Q = लक्ष्य जीन प्रतियों की संख्या / संदर्भ जीन प्रतियों की संख्या
आरक्यू = क्यू (प्रायोगिक) / क्यू (नियंत्रण)
ऊपर वर्णित प्रयोग में, जो अरेबिडोप्सिस AtSUC2 जीन की अभिव्यक्ति पर प्रकाश प्रेरण के प्रभाव की जांच करता है, AtSUC2 और GAPDH दोनों के लिए मानक नमूने बनाए गए, और निम्नलिखित मानक वक्र तैयार किए गए:
परीक्षण किये जाने वाले नमूनों में लक्ष्य जीन और आंतरिक संदर्भ जीन के लिए Ct मान निम्नानुसार हैं:
गणना के दौरान, सबसे पहले, लक्ष्य जीन और आंतरिक संदर्भ जीन के Ct मानों को मानक वक्र के रैखिक संबंध में प्रतिस्थापित किया जाता है ताकि प्रयोगात्मक और नियंत्रण दोनों समूहों में लक्ष्य जीन और आंतरिक संदर्भ जीन की पूर्ण प्रतिलिपि संख्या प्राप्त की जा सके। फिर, Q = लक्ष्य जीन प्रतियों की संख्या / संदर्भ जीन प्रतियों की संख्या के सूत्र का उपयोग करके, लक्ष्य जीन के अभिव्यक्ति स्तर को सामान्यीकृत किया जाता है।अंत में, सूत्र RQ = Q (प्रायोगिक) / Q (नियंत्रण) के अनुसार, RQ की गणना 9.71 की गई है, जो दर्शाता है कि प्रायोगिक समूह में लक्ष्य जीन का अभिव्यक्ति स्तर नियंत्रण समूह की तुलना में 9.71 गुना अधिक है।
परिणाम ग्राफपैड सॉफ्टवेयर का उपयोग करके निम्नानुसार प्लॉट किए गए हैं:
सॉफ्टवेयर के टी-टेस्ट का उपयोग करके गणना किया गया P मान 0.0008 है, जो 0.05 से कम है, जो सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर दर्शाता है और परिणाम विश्वसनीय हैं।
इस सत्र के लिए qPCR डेटा विश्लेषण का समापन हो गया है। इसके बाद, मैं आपके प्रयोगात्मक डेटा को अधिक सटीक और विश्वसनीय बनाने के लिए लागत-प्रभावी उत्पादों की एक श्रृंखला की सिफारिश करूँगा। आइए और उन्हें उठाइए!
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