दोनों दिशाओं में काम करें, miRNA अभिव्यक्ति विश्लेषण आसान हो गया

परिपक्व miRNA की लंबाई केवल 20nt के आसपास होती है, आमतौर पर, फॉरवर्ड प्राइमर इसकी पूरी लंबाई को कवर करेगा या यहां तक कि इसका एक अतिरिक्त हिस्सा भी होगा, और रिवर्स प्राइमर को रखने के लिए कोई जगह नहीं होगी। वर्तमान बाजार समाधान रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के दौरान रिवर्स ट्रांसक्रिप्ट की लंबाई बढ़ाना है। आम तरीकों में टेलिंग विधि और स्टेम-लूप विधि शामिल हैं।

1 परिचय
2. अनुशंसित उत्पाद
3. संबंधित उत्पाद सूची

1 परिचय

माइक्रोआरएनए (miRNAs) लगभग 21-23 बेस के आकार वाले एकल-स्ट्रैंडेड छोटे आरएनए होते हैं, जो डाइसर एंजाइम प्रोसेसिंग के बाद लगभग 70-90 बेस की हेयरपिन संरचना वाले एकल-स्ट्रैंडेड आरएनए अग्रदूतों से उत्पन्न होते हैं। miRNA मुख्य रूप से लक्ष्य जीन mRNA के 3'-अंत गैर-कोडिंग क्षेत्र से विशेष रूप से जुड़ता है, और पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल लक्ष्य जीन mRNA की अनुवाद प्रक्रिया को नियंत्रित करता है, जिससे mRNA अनुवाद अवरुद्ध हो जाता है और mRNA गिरावट को बढ़ावा मिलता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन अभिव्यक्ति में कमी आती है। miRNAs की भूमिका विभिन्न हृदय संबंधी बीमारियों जैसे ऑन्टोजेनेसिस, ऊतक विभेदन, कोशिका प्रसार और एपोप्टोसिस की घटना और विकास में शामिल है।

Figure 1. Schematic diagram of miRNA synthesis in vivo

चित्र 1. जीव में miRNA संश्लेषण का योजनाबद्ध आरेख

Figure 2. miRNA synthesis by tailing method

चित्र 2. टेलिंग विधि द्वारा miRNA संश्लेषण

Figure 3. miRNA synthesis by the stem-loop method

चित्र 3. स्टेम-लूप विधि द्वारा miRNA संश्लेषण

टेलिंग विधि परिपक्व miRNA में पॉली(A) टेल जोड़ने के लिए पॉलीए पॉलीमरेज़ का उपयोग करती है और cDNA के पहले स्ट्रैंड के अनुरूप लम्बी miRNA को संश्लेषित करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्राइमर के रूप में यूनिवर्सल अनुक्रम के साथ ओलिगो-डीटी का उपयोग करती है। स्टेम-लूप विधि लम्बी miRNA के अनुरूप cDNA के पहले स्ट्रैंड को संश्लेषित करने के लिए प्राइमर के रूप में स्टेम-लूप संरचना में मुड़े हुए यूनिवर्सल अनुक्रम का उपयोग करती है। स्टेम-लूप संरचना को बाद की प्रवर्धन प्रक्रिया के दौरान उपयुक्त तापमान पर खोला जाएगा और प्रासंगिक प्रवर्धन प्राइमरों के साथ संयुक्त किया गया।

तालिका नंबर एक।टेलिंग और स्टेम-लूप की तुलना

वर्ग	पीछा	स्टेम-लूप
प्रयोज्यता	एक साथ कई अलग-अलग miRNAs का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त	नमूने में कुछ miRNAs का सटीक मात्रात्मक पता लगाने के लिए उपयुक्त
फ़ायदा	एक एकल रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन उच्च थ्रूपुट के साथ कई miRNAs का पता लगा सकता है	रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा एक समय में केवल एक miRNA का ही पता लगाया जा सकता है, जिसमें मजबूत विशिष्टता होती है
प्रणाली	शामिल miRNA के साथ, उच्च सटीकता के साथ एक ही प्रतिक्रिया प्रणाली में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन	आंतरिक रूप से शामिल miRNAs को अलग किया जाता है और दोनों प्रणालियों में रिवर्स ट्रांस्क्राइब किया जाता है, जिससे त्रुटियों की संभावना रहती है
विशेषता	★★★★☆	★★★★★
संवेदनशीलता	★★★★★	★★★★☆
समय	★★★★☆	★★★★★

2. अनुशंसित उत्पाद

2.1 येसेन miRNA पुच्छीय व्युत्क्रम मात्रात्मक संयोजन (11148ES&11171ES)

Figure 4. 11148ES-Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit

चित्र 4. 11148ES-Hifair™ miRNA प्रथम स्ट्रैंड cDNA संश्लेषण किट

किट miRNA के पहले स्ट्रैंड cDNA के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए टेलिंग विधि को अपनाता है। उत्पाद में 2×Hifair™ miRNA RT बफर में miRNA टेलिंग प्रतिक्रिया और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया के लिए सभी कच्चे माल और प्राइमर शामिल हैं, और इसे सावधानीपूर्वक अनुकूलित किया गया है। यह सुनिश्चित कर सकता है कि miRNA 3' छोर की पॉली(A) संशोधन और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रियाएँ एक साथ कुशलतापूर्वक की जाती हैं।

Figure 5. 11171ES -Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

चित्र 5. 11171ES -Hieff™ miRNA यूनिवर्सल qPCR SYBR मास्टर मिक्स

विशेष रूप से miRNA मात्रात्मक पता लगाने के लिए विकसित प्रीमिक्स्ड फ्लोरोसेंस क्वांटिटेटिव पीसीआर डिटेक्शन अभिकर्मकों की एक नई पीढ़ी, जिसमें विशेष ROX पैसिव रेफरेंस डाई शामिल है, सभी qPCR उपकरणों के लिए उपयुक्त है, विभिन्न उपकरणों पर ROX की सांद्रता को समायोजित करने की आवश्यकता नहीं है, बस तैयारी प्रतिक्रिया में सिस्टम में प्राइमर और टेम्प्लेट जोड़कर प्रवर्धन किया जा सकता है। डीएनए पोलीमरेज़ रासायनिक रूप से संशोधित हॉट-स्टार्ट पोलीमरेज़ को अपनाता है, और एक विशेष बफ़र सिस्टम के साथ सहयोग करता है, जो प्रतिक्रिया की विशिष्टता और संवेदनशीलता को अधिक बनाता है, और एक व्यापक रेंज में सटीक रूप से मात्रा निर्धारित कर सकता है।

2.2 उत्पाद प्रदर्शन

2.2.1 सभी प्लेटफ़ॉर्म qPCR उपकरणों के साथ संगत

Figure 6. Compatible results with different qPCR instruments

चित्र 6. विभिन्न qPCR उपकरणों के साथ संगत परिणाम

293T कोशिकाओं के कुल RNA को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करते हुए, Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA सिंथेसिस किट (कैट# 11148ES) के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया गया।प्राप्त सीडीएनए को 10 गुना पतला किया गया, और फिर क्रमशः hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p, और U6 के आंतरिक संदर्भ जीन का पता लगाने के लिए Hieff™ miRNA यूनिवर्सल qPCR SYBR मास्टर मिक्स (कैट# 11171ES) का उपयोग किया गया।

2.2.2 उच्च पहचान दर, 10 पीजी तक

Figure 7. Amplification plot

चित्र 7. प्रवर्धन आरेख

Figure 8. Amplification plot

चित्र 8. प्रवर्धन आरेख

सिंथेटिक hsa-miR-let-7e-5p(a) और 293T सेल टोटल RNA(b) को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करते हुए, क्रमशः निम्नलिखित ग्रेडिएंट्स तक पतला किया गया: 60 प्रतियों से 606 प्रतियां (6 ग्रेडिएंट्स) और 10 pg-100 ng (5 ग्रेडिएंट्स), Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA सिंथेसिस किट (Cat# 11148ES) के साथ रिवर्स ट्रांस्क्राइब किया गया, और परिणामी cDNA को hsa-miR-let-7e -5p जीन अभिव्यक्ति के लिए Hieff™ miRNA यूनिवर्सल qPCR SYBR मास्टर मिक्स (Cat# 11171ES) के साथ पता लगाया गया।

2.2.3 उच्च विशिष्टता, एक ही परिवार में miRNAs के बीच एकल आधार अंतर को पहचानने में सक्षम

Figure 9. Distinguish single base differences between miRNAs

चित्र 9. miRNAs के बीच एकल आधार अंतर को पहचानें

मानव hsa-let-7 परिवार में कई miRNAs होते हैं, जिनमें कुछ आधार एक दूसरे से भिन्न होते हैं, या यहाँ तक कि केवल एक आधार अंतर होता है। प्रत्येक Let-7 आइसोफॉर्म (hsa-miR-let-7a~Let-7i, has-miR-98) के लिए सिंथेटिक miRNAs को Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA सिंथेसिस किट (Cat# 11148ES) का उपयोग करके cDNA में रिवर्स ट्रांसक्रिप्ट किया गया, Hieff™ miRNA यूनिवर्सल qPCR SYBR मास्टर मिक्स (Cat# 11171ES) का उपयोग करके इन miRNAs को अलग-अलग प्राइमर के साथ अलग-अलग बढ़ाया गया, और समीकरण 2-ΔCT x 100% का उपयोग करके मिलान दर की गणना की गई। परिणाम दिखाते हैं कि निकट से संबंधित उपप्रकार परिवार के सदस्यों को प्रभावी ढंग से पहचाना जा सकता है।

2.2.4 उत्कृष्ट प्रवर्धन दक्षता

Figure 10. Amplification efficiency

चित्र 10. प्रवर्धन दक्षता

Figure 11. Amplification efficiency

चित्र 11. प्रवर्धन दक्षता

miR-let-7b-5p, miR-let-7c-5p, miR-let-7e-5p, miR-let-7f-5p जीन को मानव 293T कोशिकाओं और माउस लीवर टोटल RNA को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करके प्रवर्धित किया गया। परिणामों से पता चला कि समान उत्पादों की तुलना में, Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA सिंथेसिस किट (Cat# 11148ES) ने Hieff™ miRNA यूनिवर्सल qPCR SYBR मास्टर मिक्स (Cat# 11171ES) की प्रतिक्रिया प्रणाली से बेहतरीन प्रदर्शन किया।

2.2.5 उत्कृष्ट स्थिरता

Figure 12. Product stability analysis at 37℃ for 7 days

चित्र 12. 7 दिनों के लिए 37℃ पर उत्पाद स्थिरता विश्लेषण

Figure 13. Analysis of results after 50 freeze-thaw cycles

चित्र 13. 50 फ्रीज-थॉ चक्रों के बाद परिणामों का विश्लेषण

Figure 14. Stable analytical properties of the quantitative reaction system at different temperatures for 24h

चित्र 14. 24 घंटों के लिए विभिन्न तापमानों पर मात्रात्मक प्रतिक्रिया प्रणाली के स्थिर विश्लेषणात्मक गुण

293T सेल टोटल RNA को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करते हुए Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA सिंथेसिस किट (कैट# 11148ES) के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया गया, और प्राप्त cDNA को 10 गुना पतला किया गया और Hieff™ miRNA यूनिवर्सल qPCR SYBR मास्टर मिक्स (कैट# 11171ES) के साथ पता लगाया गया। hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p, hsa-miR-let-7e-5p की अभिव्यक्ति। △Ct<0.5.

2.3 येसेन miRNA स्टेम-लूप व्युत्क्रम मात्रात्मक संयोजन (11139ES&11170ES)

Figure 15. 11139ES-Hifair™ III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)

चित्र 15. 11139ES-Hifair™ III 1st स्ट्रैंड cDNA सिंथेसिस किट (gDNA डाइजेस्टर प्लस)

किट को हाईफेयर™ III रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के आधार पर विकसित किया गया था।एंजाइम cDNA संश्लेषण की गति तेज़ है, और थर्मल स्थिरता में बहुत सुधार हुआ है। साथ ही, एंजाइम टेम्पलेट के साथ आत्मीयता को बढ़ाता है और कम मात्रा में टेम्पलेट्स और कम-कॉपी जीन के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए उपयुक्त है। हाईफ़ेयर™ III रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस की पूर्ण लंबाई वाले cDNA को संश्लेषित करने की क्षमता में भी सुधार किया गया है, जिससे 19.8 kb तक के cDNA का संश्लेषण संभव हो पाया है।

Figure 16. 11170ES-Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

चित्र 16. 11170ES-Hieff™ miRNA यूनिवर्सल qPCR SYBR मास्टर मिक्स

यह उत्पाद SYBR ग्रीन I काइमेरिक फ्लोरोसेंस विधि का उपयोग करके miRNA परिमाणीकरण के लिए एक विशेष मास्टर मिक्स है। क्योंकि miRNA अनुक्रम छोटे होते हैं और एक ही परिवार में miRNA अनुक्रम अक्सर अत्यधिक समान होते हैं, इसलिए परिमाणीकरण के दौरान विशिष्टता की अत्यधिक आवश्यकता होती है। यह उत्पाद अनुकूलित बफर के साथ हॉट-स्टार्ट डीएनए पोलीमरेज़ पर आधारित है, जो गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को बहुत कम कर सकता है; साथ ही, विशेष ROX संदर्भ डाई मास्टर मिक्स को सभी qPCR उपकरणों के लिए उपयुक्त बनाता है, और विभिन्न उपकरणों पर ROX को समायोजित करने की कोई आवश्यकता नहीं है। प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार करते समय प्राइमर और टेम्प्लेट जोड़कर प्रवर्धन किया जा सकता है।

2.3.1 सभी प्लेटफ़ॉर्म qPCR उपकरणों के साथ संगत

Figure 17. Compatible results with different qPCR instruments

चित्र 17. विभिन्न qPCR उपकरणों के साथ संगत परिणाम

माउस लीवर कोशिकाओं के कुल आरएनए को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करते हुए, हाईफेयर™ III प्रथम स्ट्रैंड के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया गया
सीडीएनए संश्लेषण किट (जीडीएनए डाइजेस्टर प्लस) (कैट # 11139ES), और प्राप्त सीडीएनए को 40 गुना पतला किया गया और क्रमशः मानव mmu-miR-125a जीन को बढ़ाने के लिए Hieff™ miRNA यूनिवर्सल qPCR SYBR मास्टर मिक्स (कैट # 11170ES) का उपयोग किया गया।

2.3.2 उच्च संवेदनशीलता, 10 पीजी तक

Figure 18. Sensitivity detection

चित्र 18. संवेदनशीलता का पता लगाना

माउस यकृत कोशिकाओं के कुल आरएनए को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करते हुए, हाईफ़ेयर™ III 1 स्ट्रैंड सीडीएनए सिंथेसिस किट (जीडीएनए डाइजेस्टर प्लस) (कैट# 11139ईएस) के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया गया, और प्राप्त सीडीएनए को क्रमिक रूप से 10 गुना (रेंज 10pg/μL) पतला किया गया। -0.1 μg/μL), म्यूरिन मूल के mmu-miR-125a, mmu-miR-132, और mmu-miR-351 जीन को प्रवर्धित करें।

2.3.3 उच्च विशिष्टता, एक ही परिवार में miRNAs के बीच एकल आधार अंतर को पहचानने में सक्षम

चित्र 19. miRNAs के बीच एकल आधार अंतर को पहचानें

मानव hsa-let-7 परिवार में कई miRNAs होते हैं, जिनमें कुछ बेस एक दूसरे से भिन्न होते हैं, या यहाँ तक कि केवल एक बेस अंतर होता है। इन miRNAs को Hieff™ miRNA यूनिवर्सल qPCR SYBR मास्टर मिक्स (कैट# 11170ES) का उपयोग करके अलग-अलग प्राइमरों के साथ अलग-अलग प्रवर्धित किया गया था, और मिलान दर की गणना 2^-Δct x 100% सूत्र का उपयोग करके की गई थी।

2.3.4 अच्छी पुनरावृत्ति

Figure 20. Repeatability detection

चित्र 20. पुनरावृत्ति का पता लगाना

रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए टेम्पलेट के रूप में मानव 293T कोशिकाओं के कुल आरएनए का उपयोग करते हुए, हाईफेयर™ III प्रथम स्ट्रैंड सीडीएनए सिंथेसिस किट (जीडीएनए डाइजेस्टर प्लस) (कैट# 11139ईएस) के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किया गया, और प्राप्त सीडीएनए को 50 गुना पतला किया गया और 90-वेल प्रतिकृति प्रयोग में मानव एचएसए-लेट-7ए जीन को बढ़ाने के लिए हाईएफ™ एमआरएनए यूनिवर्सल क्यूपीसीआर एसवाईबीआर मास्टर मिक्स (कैट# 11170ईएस) का उपयोग किया गया।

2.3.5 अच्छी स्थिरता

Figure 21. Stability analysis of 11170ES at different temperatures for 14 days

चित्र 21.14 दिनों के लिए विभिन्न तापमानों पर 11170ES का स्थिरता विश्लेषण

Figure 22. Analysis of 11170ES repeated freezing and thawing

चित्र 22. 11170ES के बार-बार जमने और पिघलने का विश्लेषण

Figure 23. Stable analysis properties of the quantitative reaction system at different temperatures for 24h

चित्र 23. 24 घंटे के लिए विभिन्न तापमानों पर मात्रात्मक प्रतिक्रिया प्रणाली के स्थिर विश्लेषण गुण

माउस लिवर कोशिकाओं के कुल आरएनए को हाईफ़ेयर™ III 1 स्ट्रैंड सीडीएनए सिंथेसिस किट (जीडीएनए डाइजेस्टर प्लस) (कैट# 11139ईएस) के साथ रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था। प्राप्त सीडीएनए को म्यूरिन एमएमयू-एमआईआर-132 जीन को बढ़ाने के लिए 100 गुना पतला किया गया था।

3. संबंधित उत्पाद सूची

2014 में स्थापित येसेन बायोटेक्नोलॉजी (शंघाई) कंपनी लिमिटेड एक उच्च तकनीक उद्यम है जो टूल एंजाइम कच्चे माल और एंटीजन एंटीबॉडी के अनुसंधान एवं विकास और उत्पादन में लगा हुआ है। इसके उत्पादों में आणविक नैदानिक एंजाइम, प्रोटीन और एंटीबॉडी शामिल हैं जिनका उपयोग फार्मास्यूटिकल्स, खाद्य सुरक्षा परीक्षण, प्रजनन, न्याय और अन्य उद्योगों में किया जाता है। हम जीवन विज्ञान के क्षेत्र में ग्राहकों को उच्च गुणवत्ता वाले उत्पाद और सेवाएँ प्रदान करने के लिए प्रतिबद्ध हैं। येसेन द्वारा प्रदान किए गए संबंधित उत्पाद इस प्रकार हैं:

तालिका 2. संबंधित उत्पाद सूची

विधि का प्रकार	प्रायोगिक प्रक्रिया	प्रोडक्ट का नाम	उत्पाद कोड
पीछा	रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन	हाईफेयर™ miRNA प्रथम स्ट्रैंड cDNA संश्लेषण किट	11148ईएस
पीछा	क्यूपीसीआर	हाईएफ़™ miRNA यूनिवर्सल qPCR SYBR मास्टर मिक्स	11171ईएस
स्टेम-लूप	रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन	हाईफेयर™ III प्रथम स्ट्रैंड cDNA संश्लेषण किट (gDNA डाइजेस्टर प्लस) (जाँच करना)	11139ईएस
स्टेम-लूप	क्यूपीसीआर	हाईएफ़™ miRNA यूनिवर्सल qPCR SYBR मास्टर मिक्स (जाँच करना)	11170ईएस

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