डायरेक्ट पीसीआर एक ऐसी प्रतिक्रिया है जो न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और न्यूक्लिक एसिड शुद्धिकरण के चरणों के बिना प्रवर्धन के लिए सीधे रक्त, पशु या पौधे के ऊतक आदि का उपयोग करती है। यह डीएनए प्रवर्धन के लिए अभूतपूर्व सुविधा लाता है, जिससे बहुत समय की बचत हो सकती है। तो डायरेक्ट पीसीआर में उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मक और उत्पाद क्या हैं?

1. डायरेक्ट पीसीआर क्या है?
2. प्रत्यक्ष पीसीआर के लिए कौन से अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है
3. डायरेक्ट पीसीआर किट के अनुप्रयोग परिदृश्य और विशेषताएं
4. उत्पाद डेटा
5. ग्राहक प्रतिक्रिया
6. उत्पाद ऑर्डरिंग जानकारी

1. डायरेक्ट पीसीआर क्या है?

दुनिया भर के अनगिनत विद्वानों द्वारा निरंतर पूरकता और सुधार के बाद, पीसीआर तकनीक पूरे जीवन विज्ञान क्षेत्र में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली, सबसे अधिक बार इस्तेमाल की जाने वाली और सबसे महत्वपूर्ण बुनियादी शोध पद्धति बन गई है। पारंपरिक पीसीआर तकनीक के व्यापक अनुप्रयोग के आधार पर विकसित टच डाउन पीसीआर, आरटी-पीसीआर, रियल-टाइम पीसीआर, मल्टी पीसीआर, आदि, साथ ही नवीनतम डिजिटल पीसीआर (डिजिटल पीसीआर) ने अधिकांश वैज्ञानिक शोधकर्ताओं के शोध को बहुत समृद्ध किया है। इन विधियों ने आधुनिक जीवन विज्ञान, विशेष रूप से आणविक जीव विज्ञान के विकास को बहुत तेज़ कर दिया है, और पूरे मानव के लिए जीवन और प्रकृति के अनुसंधान में महान योगदान दिया है। पारंपरिक पीसीआर तकनीक और इससे प्राप्त विभिन्न नई तकनीकों और नए अनुप्रयोगों के लिए एक शर्त है, यानी उच्च शुद्धता वाले न्यूक्लिक एसिड टेम्पलेट्स को पहले से प्राप्त करने की आवश्यकता है। किसी भी जैविक नमूने को पीसीआर की तकनीकी आवश्यकताओं को पूरा करने वाले न्यूक्लिक एसिड नमूने प्राप्त करने के लिए जटिल और थकाऊ नमूना प्रसंस्करण की एक श्रृंखला से गुजरना पड़ता है। डीएनए और आरएनए का पृथक्करण और निष्कर्षण हमेशा से ही बुनियादी काम रहा है जिसे संबंधित वैज्ञानिक और तकनीकी कर्मियों को हर दिन दोहराने की आवश्यकता होती है। नमूनों के बीच बहुत ज़्यादा अंतर होने के कारण, डीएनए और आरएनए के पृथक्करण और निष्कर्षण की प्रक्रिया भी बहुत अलग है। इस काम के लिए ऑपरेटरों के लिए उच्च स्तर की तकनीकी दक्षता की आवश्यकता होती है। पारंपरिक पृथक्करण और निष्कर्षण तकनीक में कुछ अत्यधिक विषैले रासायनिक अभिकर्मकों के उपयोग के कारण, लंबे समय तक संपर्क में रहने से ऑपरेटर के शरीर को अपरिवर्तनीय क्षति होगी, और प्रयोग के दौरान प्रत्यक्ष क्षति भी हो सकती है। फिनोल और क्लोरोफॉर्म जैसे रासायनिक अभिकर्मक प्रयोगशाला में महत्वपूर्ण कार्सिनोजेन्स हैं, और न्यूक्लिक एसिड पृथक्करण और पौधों के ऊतकों के निष्कर्षण की प्रक्रिया में उपयोग किए जाने वाले तरल नाइट्रोजन अपने अति-निम्न तापमान के कारण प्रयोग के दौरान ऑपरेटरों की सुरक्षा के लिए एक बड़ा खतरा पैदा करते हैं। साथ ही, जिनके पास अध्ययन करने के लिए बड़ी संख्या में नमूने हैं, उनके लिए न्यूक्लिक एसिड को अलग करना और निकालना एक श्रम-गहन कार्य है। अब बाजार में न्यूक्लिक एसिड अलगाव और निष्कर्षण किट परिपक्व हैं और कई ब्रांड हैं, लेकिन वे सभी लगभग एक जैसे हैं। चाहे वह सिलिका झिल्ली स्तंभ केन्द्रापसारक किट हो या चुंबकीय मनका विधि किट, बहुत समय की आवश्यकता होती है और लागत अधिक होती है। किट की लागत के अलावा, प्रयोगशाला उपकरणों के लिए विशेष आवश्यकताएं हैं। चुंबकीय मनका विधि में उपयोग किया जाने वाला स्वचालित कार्य केंद्र एक बहुत ही विशिष्ट बड़े पैमाने पर उच्च मूल्य वाला उपकरण है, जो प्रयोगशाला के लिए एक बहुत बड़ा खर्च है। संक्षेप में, पीसीआर प्रयोग करने से पहले, नमूना पूर्व उपचार शोधकर्ताओं के लिए एक अपरिहार्य और निरंतर सिरदर्द है। इस समस्या को कैसे हल किया जाए और न्यूक्लिक एसिड के पृथक्करण और निष्कर्षण के बिना सीधे पीसीआर प्रयोग कैसे करें, यह हमेशा एक समस्या रही है जिसके बारे में कई वैज्ञानिक शोधकर्ता और नैदानिक ​​​​प्रयोगशाला कर्मी सोचते रहे हैं।

डायरेक्ट पीसीआर एक ऐसी प्रतिक्रिया है जिसमें जानवरों या पौधों के ऊतकों का उपयोग सीधे न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के बिना प्रवर्धन के लिए किया जाता है। कई मायनों में, डायरेक्ट पीसीआर पारंपरिक पीसीआर की तरह काम करता है।मुख्य अंतर प्रत्यक्ष पीसीआर में उपयोग किए जाने वाले कस्टम बफर का है। नमूने को न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण के बिना सीधे पीसीआर प्रतिक्रिया के अधीन किया जा सकता है, लेकिन प्रत्यक्ष पीसीआर प्रतिक्रिया में शामिल एंजाइमों की सहनशीलता और बफर की अनुकूलता के लिए इसी तरह की आवश्यकताएं हैं। हालाँकि आम नमूनों में अधिक या कम पीसीआर अवरोधक होते हैं, फिर भी प्रत्यक्ष पीसीआर एंजाइम और बफर की कार्रवाई के तहत विश्वसनीय प्रवर्धन प्राप्त कर सकता है। हालाँकि, पारंपरिक पीसीआर प्रतिक्रिया को प्रतिक्रिया के लिए टेम्पलेट के रूप में उच्च गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। यदि टेम्पलेट में प्रोटीन और अन्य अशुद्धियाँ हैं, तो यह पीसीआर प्रतिक्रिया की सुचारू प्रगति को बाधित करेगा।

प्रत्यक्ष पीसीआर का सबसे पहला अनुप्रयोग क्षेत्र जानवरों और पौधों का क्षेत्र है, जैसे कि चूहों, बिल्लियों, मुर्गियों, खरगोशों, भेड़ों, मवेशियों और अन्य जानवरों के रक्त, ऊतक और बाल; पौधों की पत्तियां और बीज, आदि। इसका उपयोग जीनोटाइपिंग, ट्रांसजेनिक, प्लास्मिड डिटेक्शन, जीन नॉकआउट विश्लेषण, डीएनए स्रोत पहचान, प्रजातियों की पहचान, एसएनपी विश्लेषण और अन्य क्षेत्रों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इन क्षेत्रों में कुछ सामान्य विशेषताएं हैं, यानी, लक्ष्य जीन की सामग्री अपेक्षाकृत अधिक है, और न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण परेशानी है। इसलिए, प्रत्यक्ष पीसीआर न केवल समय बचा सकता है और परिणामों पर कम प्रभाव डाल सकता है, बल्कि लागत भी बचा सकता है।

2. प्रत्यक्ष पीसीआर के लिए कौन से अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है

2.1 नमूना लाइसेट

सैंपल लाइसेट को आप खुद तैयार कर सकते हैं या खरीद सकते हैं। लाइसेट के विभिन्न ब्रांडों के घटकों में अंतर के कारण लाइसिंग क्षमता अलग-अलग होगी, और फिर लाइसिंग समय थोड़ा अलग होगा। उदाहरण के लिए, पशु ऊतक के नमूनों की तैयारी के लिए, आमतौर पर 30 मिनट या रात भर के लिए लाइज़ करने की सिफारिश की जाती है, और वायरस के लिए लाइसेट 3-10 मिनट तक होता है।

2.2 पीसीआर मास्टर मिक्स

विशिष्ट प्रवर्धन और मजबूत प्रवर्धन क्षमता को बढ़ाने के लिए हॉट-स्टार्ट डीएनए पॉलीमरेज़ का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। प्रत्यक्ष पीसीआर के केंद्र में अत्यधिक प्रतिरोधी पॉलीमरेज़ होता है।

2.3 नमूनों में उन घटकों को हटाना या रोकना जो डीएनए प्रवर्धन को प्रभावित करते हैं

लाइसेट द्वारा सैंपल को प्रोसेस करने के बाद, प्रोटीन, लिपिड और अन्य सेल मलबे निकलेंगे, और ये पदार्थ पीसीआर प्रतिक्रिया को बाधित करेंगे। इसलिए, इन कारकों के प्रभाव को कम करने के लिए डायरेक्ट पीसीआर को संबंधित निष्कासन या अवरोधक जोड़ने की आवश्यकता है।

3. डायरेक्ट पीसीआर किट के अनुप्रयोग परिदृश्य और विशेषताएं

येसेन की डायरेक्ट पीसीआर किट सीधे पौधे, पशु ऊतक या रक्त के नमूनों और अन्य मूल नमूनों को न्यूक्लिक एसिड शुद्धिकरण के बिना बढ़ा सकती है, जो पीसीआर प्रयोगात्मक प्रक्रिया को बहुत सरल बनाती है। पीसीआर-आधारित जीनोटाइपिंग (चित्र 1) जीनोम शुद्धिकरण (चित्र 1 ए) के बिना मूल नमूने का उपयोग करके या इसके लाइसेट (चित्र 1 बी) को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करके किया गया था। सामान्य पीसीआर-आधारित जीनोटाइपिंग की तुलना में, डायरेक्ट पीसीआर किट में कम नमूना खपत, सरल संचालन, कम प्रयोगात्मक लागत और उच्च गुणवत्ता वाली मात्रात्मक नमूना पहचान है।

चित्र 1. प्रत्यक्ष पीसीआर प्रौद्योगिकी.

ए. प्रत्यक्ष विधि: पीसीआर पहचान के लिए नमूनों की एक छोटी संख्या लें और उन्हें सीधे पीसीआर मिक्स में डालें। बी. लाइसिस विधि: जीनोम को मुक्त करने के लिए नमूने को लाइसिस घोल में डालें, और पीसीआर पहचान के लिए पीसीआर मिक्स में लाइसिस सुपरनैटेंट की एक छोटी मात्रा डालें।

3.1 अनुप्रयोग

पशु जीन प्रवर्धन का पता लगाना, ट्रांसजेनिक पशु जीनोटाइपिंग, ट्रांसजेनिक पौधों की पहचान, पौधों की जीनोटाइपिंग, आदि।

3.2 विशेषताएं

★   प्रत्यक्ष: कोई डीएनए शुद्धिकरण नहीं;
★   तेज़: टेम्पलेट तैयार करने में 10 मिनट, पीसीआर प्रतिक्रिया पूरी करने में 50 मिनट;
★   सरल: नमूनों को बिना कतरने या पीसने के लिस्ड किया जा सकता है;
पीसीआर मिक्स एक मास्टर मिक्स के रूप में होता है, जो नमूना जोड़ने के चरणों को कम करता है
★   बचत: कम सामग्री खपत
★   उच्च थ्रूपुट: लिसिस प्रतिक्रिया 96-वेल प्लेट में पूरी की जा सकती है
★   प्रबल अवरोधक सहिष्णुता

4. उत्पाद डेटा

4.1 बहु-पशु सार्वभौमिक प्रकार: पशु ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट

4.1.1 सबसे तेज़: संचालन समय को छोटा करें

चित्र 2. येसेन द्वारा निर्मित पशु ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट से अधिक समय की बचत हो सकती है।

4.1.2 उदाहरण: नॉकआउट चूहों की जीनोटाइप पहचान

चित्र 3. जीन नॉकआउट पशुओं का पता लगाने के लिए पशु ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट के प्रत्यक्ष प्रवर्धन के परिणाम।

एम: 100 बीपी डीएनए सीढ़ी। लेन 1-8: टेम्पलेट के रूप में लाइसेट। +: 50 एनजी टेम्पलेट के रूप में शुद्ध जीनोमिक डीएनए। ﹣: टेम्पलेट के रूप में विआयनीकृत पानी। कई चक्र: 35 चक्र। एकल खंड (580 बीपी): नॉकआउट पशु समयुग्मीय जीनोम। एकल खंड (180 बीपी): जंगली प्रकार का जीनोम। दो खंड (580 बीपी/180 बीपी): नॉकआउट पशु विषमयुग्मीय जीनोम।

4.2 कृंतक-विशिष्ट: माउस टिशू डायरेक्ट पीसीआर किट

4.2.1 तेज़: पर्याप्त जीन रिलीज़

चित्र 4 विभिन्न लाइसिस समय के साथ माउस ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट के प्रत्यक्ष प्रवर्धन परिणाम।

एम: 100बीपी डीएनए सीढ़ी। +: टेम्पलेट के रूप में 50 एनजी शुद्ध जीनोमिक डीएनए। कई चक्र: 35 चक्र।

4.2.2 सामान्य क्षारीय लिसिस विधि से बेहतर

चित्र 5. विभिन्न लाइसिस विधियों से उपचारित चूहे की पूंछ के SOX21 जीन प्रवर्धन परिणाम।

एम: 100 बीपी डीएनए सीढ़ी। लेन 1-2: सामान्य क्षारीय लिसिस द्वारा टेम्पलेट के रूप में लाइसेट। लेन 3-4: माउस ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट द्वारा टेम्पलेट के रूप में लाइसेट। +: टेम्पलेट के रूप में 50 एनजी शुद्ध जीनोमिक डीएनए। -: टेम्पलेट के रूप में विआयनीकृत जल। कई चक्र: 35 चक्र।

4.2.3 समान उत्पादों के साथ तुलना करें

चित्र 6. विभिन्न ब्रांडों के समान उत्पादों के साथ उपचारित माउस पूंछ के SOX21 जीन प्रवर्धन परिणाम।

एम: 100 बीपी डीएनए सीढ़ी। +: टेम्पलेट के रूप में 50 एनजी शुद्ध जीनोमिक डीएनए। कई चक्र: 35 चक्र।

4.3 प्लांट टिश्यू डायरेक्ट पीसीआर किट

4.3.1 बहु-प्रकार संयंत्र नमूना सत्यापन

चित्र 7. विभिन्न पौधों की पत्तियों के प्रत्यक्ष प्रवर्धन के परिणाम।

एम: 100 बीपी डीएनए सीढ़ी। सी: टेम्पलेट के रूप में शुद्ध जीनोमिक डीएनए।लेन 1-2: टेम्पलेट के रूप में पत्ती ऊतक लाइसेट। कई चक्र: 30 चक्र।

5. ग्राहक प्रतिक्रिया

5.1 चूहे जीनोटाइपिंग

चित्र 8. बीजिंग जिशी लाइफ टेक्नोलॉजी कंपनी लिमिटेड के उपयोगकर्ताओं द्वारा माउस ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट का उपयोग करके माउस जीनोटाइप पहचान के परिणाम।

5.2 चावल डायरेक्ट पी.सी.आर.

चित्र 9. हुआज़ोंग कृषि विश्वविद्यालय के उपयोगकर्ताओं द्वारा पादप ऊतक प्रत्यक्ष पीसीआर किट का उपयोग करके चावल से संबंधित जीन का प्रवर्धन।

6. उत्पाद ऑर्डरिंग जानकारी

येसेन एक जैव प्रौद्योगिकी कंपनी है जो तीन प्रमुख जैविक अभिकर्मकों: अणुओं, प्रोटीन और कोशिकाओं के अनुसंधान, विकास, उत्पादन और बिक्री में लगी हुई है। येसेन द्वारा प्रदान किए जाने वाले उत्पाद इस प्रकार हैं।

तालिका 1. उत्पाद ऑर्डरिंग जानकारी