जब qPCR परिणाम अजीब हों तो क्या करें?
qPCR प्रयोग आसान और कभी-कभी मुश्किल लग सकते हैं। प्राइमर डिज़ाइन पूरा होने के बाद, qPCR नमूनों को PCR की तरह चरण दर चरण जोड़ा जाता है, और प्रयोग मशीन पर पूरा किया जा सकता है। डाई विधि द्वारा qPCR प्रयोगों में कई सामान्य समस्याएं हैं और संभावित कारणों और समाधानों को देखते हुए, हमें उम्मीद है कि आप qPCR प्रयोगों में परेशानियों को हल करने के लिए उनका उपयोग कर सकते हैं।
1. क्यूपीसीआर क्या है?
2. असामान्य qPCR प्रवर्धन वक्र
3. असामान्य qPCR पिघलने वक्र
4. ऑर्डरिंग जानकारी
5. संबंधित उत्पाद
6. पढ़ने के संबंध में
1. क्यूपीसीआर क्या है?
जब से पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन तकनीक (पीसीआर) का आविष्कार हुआ है, पीसीआर शायद अपनी सादगी, सस्तेपन, विश्वसनीयता, तेज़ी और उच्च संवेदनशीलता के कारण आणविक जीव विज्ञान में सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है। qPCR पीसीआर तकनीक द्वारा विकसित एक तकनीक है। डीएनए प्रवर्धन प्रक्रिया के दौरान, फ्लोरोसेंट रंगों के साथ प्रत्येक पीसीआर चक्र के बाद उत्पादों की कुल मात्रा का पता लगाने की विधि में न केवल पीसीआर की तेज़ी और संवेदनशीलता है, बल्कि अधिक विशिष्टता और उच्च, वास्तविक समय की निगरानी, दोहराए जाने योग्य और सटीक मात्रा का ठहराव, और अन्य फायदे भी हैं। qPCR एक ऐसी तकनीक है जो पीसीआर प्रक्रिया के दौरान वास्तविक समय में न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन उत्पादों की निगरानी के लिए एक क्वांटिटेटिव रियल टाइम पीसीआर प्रवर्धन डिवाइस, अर्थात् एक qPCR उपकरण का उपयोग करती है। qPCR सीटी मान और मानक वक्र के विश्लेषण के माध्यम से शुरुआती टेम्पलेट के मात्रात्मक विश्लेषण का एहसास करता है। 1992 में, जापानी हिगुची ने पहली बार "वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर तकनीक" का प्रस्ताव रखा। 1996 में, अमेरिकन बायोलॉजिकल कंपनी ने दुनिया का पहला फ्लोरोसेंट क्वांटिटेटिव पीसीआर इंस्ट्रूमेंट लॉन्च किया, जो एक पीसीआर एम्पलीफिकेशन थर्मल साइकिल सिस्टम, फ्लोरोसेंस डिटेक्शन ऑप्टिकल सिस्टम और कंप्यूटर और एप्लीकेशन सॉफ्टवेयर से बना है। यह फ्लोरोसेंट डाई या फ्लोरोसेंट जांच के माध्यम से वास्तविक समय में न्यूक्लिक एसिड प्रवर्धन उत्पादों की निगरानी कर सकता है। गणितीय फ़ंक्शन संबंध के माध्यम से, परिणाम विश्लेषण के लिए सॉफ़्टवेयर के साथ संयुक्त, परीक्षण किए जाने वाले नमूने की प्रारंभिक टेम्पलेट राशि की गणना का एहसास होता है। इसलिए, वास्तविक समय फ्लोरोसेंट क्वांटिटेटिव पीसीआर तकनीक का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। qPCR के लिए फ्लोरोसेंट लेबलिंग विधियों को SYBR ग्रीन I डाई विधि पर आधारित फ्लोरोसेंट डाई मोज़ेक विधि, ताकमान जांच विधि (साइक्लिंग जांच, आणविक ब्रेकन, आदि) पर आधारित फ्लोरोसेंट जांच विधि, क्वेंचर डाई प्राइमर विधि में विभाजित किया गया है।
qPCR प्रयोग आसान और कभी-कभी मुश्किल लग सकते हैं। प्राइमर डिज़ाइन पूरा होने के बाद, qPCR नमूनों को PCR की तरह चरण दर चरण जोड़ा जाता है, और प्रयोग मशीन पर पूरा किया जा सकता है। हालाँकि, कई छोटी-छोटी बातों पर ध्यान देने की ज़रूरत है, जैसे कि पाइप की दीवार पर कोई तरल पदार्थ न लटका हो, पाइप में कोई बुलबुले न हों, और प्रयोगात्मक त्रुटियों या अजीब प्रयोगात्मक परिणामों को कम करने के लिए पाइप की दीवार, पाइप कवर आदि के बीच सीधे संपर्क को कम करने की आवश्यकता हो। ज़ियाओयी ने डाई विधि द्वारा qPCR प्रयोगों में कई सामान्य समस्याओं को संकलित किया है और संभावित कारण और समाधान दिए हैं, जिन्हें हम आशा करते हैं कि आप qPCR प्रयोगों में परेशानियों को हल करने के लिए उपयोग कर सकते हैं।
2. असामान्य qPCR प्रवर्धन वक्र
2.1 प्रवर्धन वक्र के लघुगणकीय आरेख के आधार रेखा चरण में असामान्यताएं
चित्र 1. प्रवर्धन प्लॉट
संभावित कारण:
अनुचित आधार रेखा सेटिंग.
समाधान:
आधार रेखा के अंतिम बिंदु मान को बढ़ाने की अनुशंसा की जाती है।समायोजन उदाहरण आरेख इस प्रकार है।
चित्र 2. प्रवर्धन प्लॉट
2.2 प्रवर्धन वक्र लॉग प्लॉट वक्र विभाजन
चित्र 3. प्रवर्धन प्लॉट
संभावित कारण:
आधार रेखा बहुत ऊंची निर्धारित की गई है।
समाधान:
बेसलाइन के अंतिम बिंदु मान को कम करने की अनुशंसा की जाती है। समायोजन उदाहरण आरेख इस प्रकार है।
2.3 असमान प्रवर्धन वक्र रैखिकता प्लॉट
चित्र 4. प्रवर्धन प्लॉट
संभावित कारण:
1)पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब को कसकर बंद नहीं किया गया था और प्रतिक्रिया समाधान लीक हो गया।
2)फांसी दीवार के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया समाधान।
3) उपकरण अंशांकित नहीं है (स्वचालित अंशांकन या ROX अंशांकन सहित)।
4) प्रणाली में कई अवरोधक हैं, जिसके कारण प्रतिदीप्ति अस्थिर हो जाती है।
5) उपकरण के अत्यधिक उपयोग के परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति संग्रहण अस्थिर हो जाता है।
समाधान:
1)पाइप कवर को कसकर दबाएं।
2) अभिकर्मक को अच्छी तरह मिलाएं, और पूर्ण अपकेन्द्रण के बाद इसे सावधानीपूर्वक मात्रात्मक उपकरण में डालें।
3) उपकरण को कैलिब्रेट करें.
4) आरएनए शुद्धता में सुधार करें और उपयुक्त रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन अभिकर्मकों का चयन करें।
2.4 पठार पर प्रवर्धित वक्र रेखीय ग्राफ ज़िगज़ैग
चित्र 5. प्रवर्धन प्लॉट
संभावित कारण:
1) आरएनए की शुद्धता कम होती है तथा उसमें अनेक अशुद्धियाँ होती हैं।
2) इस उपकरण का उपयोग बहुत लम्बे समय तक किया जाता है।
समाधान:
1) उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए को पुनः निकालें।
2) अशुद्धियों की सांद्रता को कम करने के लिए आरएनए टेम्पलेट को पतला करें।
3) उपकरण को अंशांकित करें.
2.5 प्रवर्धन वक्र का रेखीय आरेख पठार तक पहुँचने में विफल रहता है
चित्र 6. प्रवर्धन प्लॉट
संभावित कारण:
1) कम टेम्पलेट सांद्रता (सीटी मान लगभग 35)।
2) प्रवर्धन चक्र बहुत कम हैं।
3) अभिकर्मक प्रवर्धन की कम दक्षता (छोटा सीटी, लेकिन पठार तक पहुंचने में भी असमर्थ)।
समाधान:
1) टेम्पलेट की सांद्रता बढ़ाएँ.
2) चक्रों की संख्या बढ़ाएँ.
3) बढ़ती हुई Mg2+ एकाग्रता।
2.6 प्रवर्धन वक्र रेखीय प्लॉट पठार ढलान
चित्र 7. प्रवर्धन प्लॉट
संभावित कारण:
1) गिरावट की उपस्थिति (प्रवर्धन उत्पाद गिरावट, SYBR गिरावट)।
2) ट्यूब का ढक्कन ठीक से ढका नहीं है और अभिकर्मक वाष्पीकृत हो गया है।
3) सीडीएनए सांद्रता बहुत अधिक है (यदि सीटी मान बहुत छोटा है, तो प्रतिदीप्ति सीमा अधिक हो जाती है, और शिथिलता अधिक गंभीर होती है)।
4) ट्यूब में हवा के बुलबुले बनते हैं, फिर वे गायब हो जाते हैं।
समाधान:
1) प्रणाली की शुद्धता में सुधार करें.
2) सीडीएनए की मात्रा कम करें (टेम्पलेट को पतला करें)।
3) आधार रेखा का अंतिम बिंदु मान घटाएँ.
2.7 प्रवर्धन वक्र में Ct का बड़ा मान
चित्र 8. प्रवर्धन प्लॉट
संभावित कारण:
1) टेम्पलेट्स की कम मात्रा.
2) कम प्रवर्धन दक्षता.
3) पीसीआर टुकड़ा बहुत लंबा है.
4) प्रतिक्रिया प्रणाली में अवरोधकों की उपस्थिति।
समाधान:
1) तनुकरण समय को कम करें या टेम्पलेट की मात्रा बढ़ा दें ताकि Ct मान यथासंभव 15 से 30 के बीच रहे।
2) प्रतिक्रिया की स्थितियों को अनुकूलित करें, तीन-चरणीय प्रवर्धन प्रक्रिया का प्रयास करें, या प्राइमरों को पुनः डिज़ाइन करें।
3) पीसीआर उत्पाद की लंबाई 100-150 बीपी के भीतर डिज़ाइन की गई है, 300 बीपी से अधिक की अनुशंसा नहीं की जाती है।
4) उच्च शुद्धता टेम्पलेट्स का पुनरुत्पादन.
2.8 प्रवर्धन वक्रों की खराब पुनरावृत्ति
चित्र 9. प्रवर्धन प्लॉट
संभावित कारण:
1) बड़ी स्पाइकिंग त्रुटियाँ.
2) अभिकर्मक और प्रणालियाँ अच्छी तरह मिश्रित नहीं हैं।
3) सीडीएनए की कम प्रतिलिपि संख्या.
4) कोई रॉक्स अंशांकन का उपयोग नहीं किया गया था।
समाधान:
1) पिपेट का अंशांकन.
2) प्रतिक्रिया प्रणाली का पूर्ण मिश्रण।
3) कम टेम्पलेट सांद्रता, खराब पुनरावृत्ति, 4-6 मिश्रित छिद्र, तथा बड़े मानों के 1-2 विचलन को उचित रूप से त्यागा जा सकता है।
4) रॉक्स अंशांकन का उपयोग करना सबसे अच्छा है। यदि उपयोग किए गए अभिकर्मक में रॉक्स नहीं है, तो संदर्भ डाई को None के रूप में चुना जाना चाहिए।
2.9 बेतरतीब प्रवर्धन वक्र
चित्र 10. प्रवर्धन प्लॉट
संभावित कारण:
रॉक्स सांद्रता और मॉडल के बीच बेमेल।
समाधान:
उपकरण पर संदर्भ डाई सेटिंग को ROX से NONE में बदलें और देखें कि क्या प्रवर्धन वक्र सामान्य हो जाता है।
2.10 एनटीसी पीकिंग
2.10.1 Ct>35, गलनांक वक्र Tm मान <80℃
चित्र 11. प्रवर्धन प्लॉट
संभावित कारण:
प्राइमर डिमराइजेशन परिणाम.
समाधान:
अनुकूलित प्राइमर्स.
2.10.2 सीटी मान <35, एनटीसी पिघलने वक्र और जीन पिघलने वक्र शिखर आकार ओवरलैप
चित्र 12. प्रवर्धन प्लॉट
संभावित कारण:
प्रतिक्रिया प्रणाली का संदूषण.
समाधान:
प्रदूषण के स्रोतों की एक-एक करके जाँच करें।
3. असामान्य qPCR पिघलने वक्र
3.1 एकल शिखर पिघलने वाला वक्र लेकिन तीव्र नहीं
चित्र 13. पिघलन वक्र प्लॉट
संभावित कारण:
1) यह अभिकर्मक संरचना और उपकरण मॉडल से संबंधित है।
2) समान आकार के टुकड़ों के गैर-विशिष्ट प्रवर्धन की उपस्थिति।
समाधान:
1) शिखर की शुरुआत से लेकर शिखर के बंद होने तक का तापमान अंतराल 7°C से अधिक नहीं होना चाहिए। परिणाम प्रयोग करने योग्य माने जाते हैं, यानी एकल शिखर।
2) निर्धारण में सहायता के लिए उच्च सांद्रता एगरोज़ वैद्युतकणसंचलन (जैसे 3% एगरोज़) का प्रयोग किया गया।
3.2 पिघलने का वक्र दोहरा शिखर वाला है और निचला शिखर Tm 80°C से पहले है
चित्र 14. पृथक्करण वक्र
संभावित कारण:
प्राइमर डिमर्स की उपस्थिति.
समाधान:
एनीलिंग तापमान बढ़ाएं, प्राइमर सांद्रता घटाएं, या प्राइमरों को पुनः डिजाइन करें।
3.3 पिघलने का वक्र दोहरा शिखर वाला है और निचला शिखर Tm 80°C के बाद है
चित्र 15. पृथक्करण वक्र
संभावित कारण:
1) खराब प्राइमर विशिष्टता गैर-विशिष्ट उत्पादों के प्रवर्धन की ओर ले जाती है।
2) जीडीएनए संदूषण.
समाधान:
1) ब्लास्ट प्राइमर विशिष्टता की जांच करें, यदि खराब हो तो पुनः डिजाइन करें।
2) एनआरसी नकारात्मक नियंत्रण द्वारा पुष्टि, यदि कोई हो, तो टेम्पलेट को पुनः तैयार करने की आवश्यकता है।
3.4 अव्यवस्थित गलन वक्र शिखर
चित्र 16. पिघलन वक्र प्लॉट
संभावित कारण:
1) प्रतिक्रिया प्रणाली का संदूषण.
2) अभिकर्मकों को तेज रोशनी या उच्च तापमान के संपर्क में लाने से अभिकर्मक विफल हो जाता है।
3) उपकरण का लम्बे समय से अंशांकन नहीं किया गया है।
4) उपभोग्य सामग्रियों और उपकरणों के बीच बेमेल।
समाधान:
1) संदूषण की पुष्टि करने के लिए एनटीसी और एनआरसी परिणामों को संयोजित करते हुए, पानी, प्राइमर्स, एंजाइम्स और पर्यावरण से संदूषण को एक-एक करके बाहर करने की सिफारिश की जाती है।
2) नए अभिकर्मकों के साथ तुलनात्मक प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है।
3) नियमित उपकरण अंशांकन रखरखाव की सिफारिश की जाती है।
4) उपभोग्य सामग्रियों के लिए संबंधित उपकरण की आवश्यकताओं की पुष्टि करें।
3.5 पिघलने वाले वक्र के सामने के छोर पर कृत्रिम चोटियाँ
चित्र 17. पिघलन वक्र प्लॉट
संभावित कारण:
रॉक्स सांद्रता मॉडल से मेल नहीं खाती.
समाधान:
यह देखने के लिए कि पिघलने का वक्र सामान्य है या नहीं, रॉक्स सुधार को रद्द करने की सिफारिश की जाती है।
चित्र 18. पिघलन वक्र प्लॉट
4. ऑर्डरिंग जानकारी
तालिका 1. ऑर्डरिंग जानकारी
| प्रोडक्ट का नाम | उत्पाद कोड | विनिर्देश |
| Hieff Unicon™ यूनिवर्सल ब्लू qPCR मास्टर मिक्स (डाई आधारित) | 11184ES03 | 1 एमएल |
| 11184ES08 | 5×1 एमएल | |
| 11184ES50 | 50×1 एमएल | |
| 11184ES60 | 100×1 एमएल |
5. संबंधित उत्पाद
येसेन द्वारा उपलब्ध कराए गए उत्पाद इस प्रकार हैं।
तालिका 2. संबंधित उत्पाद
| उत्पाद स्थिति | प्रोडक्ट का नाम | उत्पाद कोड |
| एक-चरणीय gDNA निष्कासन और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन | हाईफ़ेयर™वी एक-चरण आरटी-जीडीएनए पाचन सुपरमिक्स qPCR के लिए (जाँच करना) | 11142ईएस |
| उच्च संवेदनशीलता मास्टर मिक्स (gDNA हटाने के चरण के साथ) | qPCR के लिए हाईफ़ेयर™ III प्रथम स्ट्रैंड cDNA संश्लेषण सुपरमिक्स (gDNA डाइजेस्टर प्लस) | 11141ईएस |
| उच्च संवेदनशीलता किट (gDNA हटाने के चरण के साथ) | हाईफ़ेयर™ III 1 स्ट्रैंड cDNA सिंथेसिस किट (gDNA डाइजेस्टर प्लस) (जाँच करना) | 11139ईएस |
| साधारण मात्रात्मक मास्टर मिक्स (जांच विधि) | Hieff™ qPCR TaqMan जांच मास्टर मिक्स (जाँच करना) | 11205ईएस |
6. पढ़ने के संबंध में
डीएनएसे I और बायोमेडिसिन में उनके अनुप्रयोग
रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस चयन के दिशानिर्देश