डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिअस I (DNase I) एक एंडोन्यूक्लिअस है, इसका उपयोग न केवल आरएनए अखंडता को बनाए रखने के लिए किया जाता है, बल्कि डीएनए फुटप्रिंट विश्लेषण, यादृच्छिक डीएनए लाइब्रेरी बनाने, सेल लाइसेट्स या प्रोटीन अर्क में चिपचिपाहट को कम करने आदि के लिए भी किया जाता है। एक शब्द में, DNase I का उपयोग लगभग किसी भी अनुप्रयोग में किया जा सकता है जिसमें डीएनए के एंजाइम क्लीवेज की आवश्यकता होती है। निम्नलिखित DNase I और इसके विशिष्ट अनुप्रयोग का विस्तृत परिचय है।

1. डीएनएसे I क्या है?
2. डीएनए-मुक्त आरएनए निष्कर्षण की तैयारी के लिए डीएनएसे I
3. टेम्पलेट डीएनए को हटाने के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए डीएनएसे I
4. rRNA हटाने के लिए DNase I
5. डीएनए लेबलिंग के लिए डीएनएसे I
6. अन्य अनुप्रयोग
7. DNase I उत्पाद चयन गाइड

1. डीएनएसे I क्या है?

डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिऐस I (DNase I) एक गैर-विशिष्ट एंडोन्यूक्लिऐस है जो एकल या दोहरे स्ट्रैंड वाले डीएनए को पचा सकता है, जो विभिन्न ऊतकों और शरीर के तरल पदार्थों में मौजूद होता है। यह फॉस्फोडाइस्टर बॉन्ड को हाइड्रोलाइज करके 5'-फॉस्फेट समूह और 3'-OH समूह वाले मोनो- और ऑलिगोडेऑक्सीन्यूक्लियोटाइड का उत्पादन कर सकता है। DNase I की इष्टतम कार्यशील pH सीमा 7-8 है, इसकी गतिविधि Ca2+ पर निर्भर करती है, और इसे Mn2+, Mg2+, Zn2+ आदि जैसे द्विसंयोजक धातु आयनों द्वारा सक्रिय किया जा सकता है। Mg2+ की उपस्थिति में, DNase I बेतरतीब ढंग से डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए की किसी भी साइट को काटता है; Mn2+ की उपस्थिति में, DNase I एक ही साइट पर डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए को काट सकता है ताकि एक कुंद अंत या 1-2 न्यूक्लियोटाइड चिपचिपा अंत ओवरहैंग बन सके।

चित्र 1. Mg2+ और Mn2+ की उपस्थिति में DNase I द्वारा dsDNA के विभाजन का योजनाबद्ध आरेख।

हालाँकि DNase I दरारों को आम तौर पर गैर-विशिष्ट दरार माना जाता है, DNase I कुछ अनुक्रम खंडों पर कार्य करने की अधिक संभावना है, जैसे कि मामूली नाली क्षेत्र, और प्यूरीन-पाइरीमिडीन अनुक्रमों के दरारों के लिए अधिक प्रवण है। हालाँकि, जब DNase I विषम dsDNA पर कार्य करता है, तो सभी चार बेस विभाजित हो जाएँगे, और एक विशिष्ट बेस पर प्रभाव अन्य बेस की तुलना में 3 गुना अधिक नहीं होगा।

2. डीएनए-मुक्त आरएनए निष्कर्षण की तैयारी के लिए डीएनएसे I

जैविक प्रयोगों में, पहला कदम आरएनए के विभिन्न कार्यों का अध्ययन करने के लिए न्यूक्लिक एसिड तैयार करना है। हालाँकि, चूँकि डीएनए और आरएनए अक्सर सेल लिसिस प्रक्रिया के दौरान एक साथ निकलते हैं, इसलिए दोनों में हस्तक्षेप से बचा नहीं जा सकता है, चाहे कोई भी निष्कर्षण समाधान इस्तेमाल किया जाए, इसलिए हस्तक्षेप को दूर करने के लिए विशिष्ट एंजाइमों का उपयोग करने की आवश्यकता होती है। उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए निष्कर्षण के लिए, नमूने से अवशिष्ट डीएनए को हटाने के लिए DNase I का उपयोग किया जाता है।

डीएनएस I डबल-स्ट्रैंडेड और सिंगल-स्ट्रैंडेड डीएनए को ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड्स और सिंगल न्यूक्लियोटाइड्स में विघटित कर सकता है, और आरएनए तैयारी उत्पाद में डीएनए को प्रभावी ढंग से विघटित किया जा सकता है। फिर स्टॉप बफर के साथ गर्म करके डीएनएस I को निष्क्रिय किया जाता है। गर्म करने की प्रक्रिया के दौरान, आरएनए अणु की हेयरपिन संरचना को खोला जा सकता है, जो रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया में आरएनए के सीधे प्रवेश की सुविधा प्रदान करता है।
आरएनए की गुणवत्ता काफी हद तक प्रयोगात्मक डेटा को सीधे प्रभावित करेगी। सामान्य तौर पर, आरएनए निष्कर्षण के दौरान जीडीएनए अवशेषों को पूरी तरह से टाला नहीं जा सकता है, इसलिए, आमतौर पर डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों (जैसे एमआरएनए अभिव्यक्ति विश्लेषण, ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण, आदि) को चुनौती देने से पहले अवशिष्ट जीडीएनए को पचाने के लिए डीएनएस I के साथ आरएनए नमूनों का इलाज करने की सिफारिश की जाती है। जीडीएनए को पचाने का चरण आरएनए निष्कर्षण के दौरान, आरएनए निष्कर्षण के बाद या आरएनए रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन से पहले किया जा सकता है।उत्पाद स्थिति के अनुसार, येसेन द्वारा प्रदान किए गए उत्पाद इस प्रकार हैं:

तालिका 1: आरएनए निष्कर्षण या रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन से पहले डीएनए हटाने से संबंधित उत्पादों की सूची

3. टेम्पलेट डीएनए को हटाने के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए डीएनएसे I

इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन (IVT) मुख्य रूप से डीएनए को एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग करता है, साथ ही इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से आरएनए प्राप्त करने के लिए संबंधित सब्सट्रेट और बफर का उपयोग करता है। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रयोगों में, टी7, टी3 और एसपी6 जैसे आरएनए पॉलीमरेज़ का उपयोग आमतौर पर आरएनए संश्लेषण के लिए किया जाता है। संश्लेषित आरएनए में डीएनए अवशेष हो सकते हैं। डीएनए अवशेषों को हटाना डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के विकास के लिए फायदेमंद है। उदाहरण के लिए, mRNA वैक्सीन विकास चरण में, अवशेषों को हटाना एक महत्वपूर्ण कदम है, जो डाउनस्ट्रीम शुद्धिकरण की कठिनाई को कम कर सकता है और उत्पाद की शुद्धता को बढ़ा सकता है। डीएनए टेम्पलेट को आमतौर पर रिकॉम्बिनेंट DNase I (RNase-मुक्त) का उपयोग करके हटाया जाता है।mRNA संश्लेषण प्रक्रिया के अनुसार, येसेन द्वारा प्रदान किए गए उत्पाद इस प्रकार हैं: