वैज्ञानिक नए जीन को बांधने के लिए कौन से एंजाइम का उपयोग करते हैं? कहने की ज़रूरत नहीं है, डीएनए लाइगेज भी इसमें शामिल है। तो फिर डीएनए लाइगेज पुनः संयोजक डीएनए में इतना महत्वपूर्ण क्यों है? क्योंकि डीएनए लाइगेज लक्ष्य खंड को वेक्टर से जोड़ने के लिए जिम्मेदार है, जो प्रयोग की सफलता को निर्धारित करने वाले प्रमुख तत्वों में से एक है। डीएनए लाइगेज के एक प्रकार के रूप में, आणविक क्लोनिंग प्रयोगों में टी4 डीएनए लाइगेज क्या भूमिका निभाता है? यह कैसे काम करता है? टी4 डीएनए लाइगेज का विस्तृत परिचय आगे दिया जाएगा।

1. टी4 डीएनए लाइगेस क्या है?
2. टी4 डीएनए लाइगेज का कार्य क्या है?
3. येसेन बायोटेक टी4 डीएनए लाइगेज का उपयोग एनजीएस एडाप्टर लाइगेशन के लिए किया जा सकता है
4. येसेन बायोटेक टी4 डीएनए लाइगेज के लिए चयन गाइड

1. टी4 डीएनए लाइगेस क्या है?

टी4 डीएनए लाइगेज एक एटीपी-निर्भर लाइगेज है जो डीएनए अणुओं के बीच बंधन प्रतिक्रिया को उत्प्रेरित करता है। यह मुख्य रूप से 3'-हाइड्रॉक्सिल और 5'-फॉस्फेट सिरों को जोड़कर फॉस्फोडाइस्टर बनाता है। डीएनए लाइगेज सभी जीवों में डीएनए प्रतिकृति और मरम्मत प्रक्रियाओं में शामिल होते हैं। फेज-एनकोडेड टी4 डीएनए लाइगेज ई. कोलाई के फेज टी4 संक्रमण के दौरान निर्मित होता है।
जेनेटिक इंजीनियरिंग में इस्तेमाल किए जाने वाले लाइगेज मुख्य रूप से ई. कोली डीएनए लाइगेज और टी4 डीएनए लाइगेज हैं, वर्तमान में बाद वाले का अधिक व्यापक रूप से उपयोग किया जा रहा है। टी4 डीएनए लाइगेज डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए, डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए या डीएनए/आरएनए हाइब्रिड स्ट्रैंड पर सिंगल-स्ट्रैंडेड निक्स की मरम्मत कर सकता है ताकि दो आसन्न न्यूक्लियोटाइड को जोड़ा जा सके, और डीएनए की मरम्मत और पुनर्संयोजन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
पुनः संयोजक प्लास्मिड निर्माण प्रक्रिया में, T4 DNA लाइगेज का उपयोग प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पुनः संयोजक प्लास्मिड निर्माण प्रयोग को पूरा करने के लिए किया जा सकता है। यह डबल-स्ट्रैंडेड DNA के 5'-P सिरे और 3'-OH सिरे के बीच फॉस्फोडाइस्टर बॉन्ड के निर्माण को उत्प्रेरित कर सकता है और चिपचिपे सिरे के कनेक्शन और कुंद सिरे के कनेक्शन के लिए इसकी कनेक्शन दक्षता अच्छी है।

चित्र 1. टी4 डीएनए लाइगेज तंत्र

2. टी4 डीएनए लाइगेज का कार्य क्या है?

2.1 वेक्टर निर्माण

वेक्टर निर्माण प्रयोगों में, विभिन्न प्रतिबंध एंजाइम विभिन्न प्रकार के सिरों का उत्पादन कर सकते हैं। विभिन्न सिरों के लिए, T4 DNA लाइगेज की अलग-अलग बंधन रणनीतियाँ होंगी।

2.1.1 प्रतिबंध एंजाइमों के साथ क्लोनिंग, एकल डाइजेस्ट द्वारा उत्पादित चिपचिपे सिरे

वेक्टर के निर्माण के दौरान, यदि लक्ष्य जीन के डीएनए टुकड़े को काटने के लिए समान प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएज का उपयोग किया जाता है और वेक्टर अणु समान चिपचिपा अंत उत्पन्न कर सकता है, तो टी 4 डीएनए लिगेज सीधे पुनर्संयोजन कनेक्शन को अंजाम दे सकता है। हालाँकि, क्योंकि चिपचिपा छोर समान हैं, इसलिए लक्ष्य जीन को आगे या पीछे की दिशा में वेक्टर में डाला जा सकता है, जो आसानी से सही पुनः संयोजक क्लोन के लिए स्क्रीनिंग के कार्यभार को बढ़ा देगा। वेक्टर निर्माण के लिए डबल-एंजाइम पाचन विधि का उपयोग करने पर विचार करें।
इसके अलावा, एकल एंजाइम पाचन द्वारा तैयार वेक्टर के संयोजी सिरों को भी जोड़ा जा सकता है, और फिर T4 DNA लाइगेज की क्रिया के तहत न्यूक्लियोटाइड्स के बीच फॉस्फोडाइस्टर बॉन्ड बनते हैं, जिसके परिणामस्वरूप वेक्टर का स्व-बंधन होता है। पचाए गए वेक्टर के उपचार के लिए क्षारीय फॉस्फेट का उपयोग करने से वेक्टर के 5' छोर पर फॉस्फेट समूह को हटाया जा सकता है ताकि वेक्टर स्व-बंधन को पूरा न कर सके। इस प्रकार, T4 DNA लाइगेज की क्रिया के तहत, वेक्टर और लक्ष्य खंड पुनः संयोजक वेक्टर के निर्माण को पूरा करने के लिए जुड़े हुए हैं।

2.1.2 प्रतिबंध एंजाइमों के साथ क्लोनिंग, डबल डाइजेस्ट द्वारा उत्पादित चिपचिपे सिरे

वेक्टर निर्माण की प्रक्रिया में, यदि अलग-अलग चिपचिपे सिरों वाले दो प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग क्रमशः लक्ष्य खंड और वेक्टर को पचाने के लिए किया जाता है, तो दो अलग-अलग चिपचिपे सिरे उत्पन्न किए जा सकते हैं। इस बिंदु पर, T4 DNA लाइगेज चुनिंदा रूप से समान चिपचिपे सिरों को बांध सकता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि लक्ष्य खंड सही दिशा में वेक्टर में डाला गया है। जब चित्र 2 में लक्ष्य खंड और वेक्टर को एक ही समय में EcoR I और BamH I के साथ पचाया जाता है, तो समान चिपचिपे सिरों को जोड़ा जा सकता है। लक्ष्य खंड और वेक्टर के बीच केवल एक ही बंधाव दिशा होती है।

चित्र 2. डबल-एंजाइम पाचन द्वारा उत्पन्न चिपचिपा अंत बंधन^[1]

2.1.3 प्रतिबंध टुकड़ों की क्लोनिंग, कुंद अंत

कुछ प्रतिबंध एंडोन्यूक्लिएसेस एंजाइमेटिक क्लीवेज के दौरान कुंद सिरे भी उत्पन्न कर सकते हैं, जैसे कि Sma I और अन्य। T4 DNA लाइगेज सीधे वेक्टर और इंसर्ट के बीच फॉस्फोडाइस्टर बॉन्ड बना सकता है, और बेस के बीच पेयरिंग की कोई आवश्यकता नहीं है। हालाँकि, इस विधि में लिगेशन दक्षता कम है और वेक्टर सेल्फ-लिगेशन की संभावना है। आम तौर पर, कुंद सिरों को चिपचिपे सिरों में बदला जा सकता है और फिर लिगेट किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लक्ष्य खंड के सिरों और वेक्टर और कृत्रिम रूप से चिपचिपे पूरक सिरों में क्रमशः पूरक पॉली ए और पॉली टी बेस जोड़ने से टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइडिल ट्रांसफ़ेरेज़ द्वारा कनेक्शन दक्षता में सुधार होता है।

2.1.4 टीए क्लोनिंग

टीए क्लोनिंग में इस्तेमाल किए जाने वाले टी वेक्टर में 3' छोर पर टी-ओवरहैंग होता है। जब लक्ष्य खंड का डीएनए अनुक्रम अस्पष्ट होता है, तो लक्ष्य जीन खंड को टीए क्लोनिंग द्वारा टी वेक्टर से जोड़ा जा सकता है, और लक्ष्य जीन को अनुक्रमण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। पीसीआर में इस्तेमाल किए जाने वाले टैक डीएनए पोलीमरेज़ में टर्मिनल ट्रांसफ़ेज़ गतिविधि होती है और यह डीएनए खंड के 3' छोर पर एक न्यूक्लियोटाइड "ए" जोड़ सकता है। टी4 डीएनए लाइगेज टैक डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा प्रवर्धित उत्पाद को सीधे टी वेक्टर से जोड़ सकता है, और पीसीआर प्रवर्धित उत्पाद कृत्रिम एडेप्टर जोड़े बिना कुशल क्लोनिंग के उद्देश्य को प्राप्त कर सकता है।

चित्र 3. टीए क्लोनिंग का कार्यप्रवाह^[2]

2.2 एनजीएस एडाप्टर लिगेशन

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पुस्तकालय के निर्माण के दौरान, अनुक्रमण को पूरा करने के लिए अनुक्रमण चिप पर प्रवाह सेल पर तय करने से पहले कृत्रिम एडाप्टर को पीसीआर उत्पाद से जोड़ना आवश्यक है। टीए क्लोनिंग लिगेशन लिंकर लाइब्रेरी बिल्डिंग एक बहुत ही सामान्य तकनीकी साधन है, और इसका सिद्धांत उपर्युक्त टीए क्लोनिंग के समान है। अनुक्रमित किए जाने वाले डीएनए टुकड़े को 5 'अंत में फॉस्फोराइलेट किया जाता है और 3' छोर पर "ए" जोड़ा जाता है, इसे पूरक किया जाता है और "टी" चिपचिपा छोर के साथ एडाप्टर के साथ जोड़ा जाता है। फिर मशीन द्वारा पूरा डबल स्ट्रैंड बनाया जाता है और अनुक्रमित किया जाता है।
टीए बंधन के दौरान, विभिन्न नमूना प्रकार या न्यूक्लिक एसिड टुकड़ा संरचना की जटिलता बंधन की दक्षता को प्रभावित करेगी, इसलिए विभिन्न प्लेटफार्मों के एडाप्टर का भी अंतिम लाइब्रेरी परिणाम पर प्रभाव पड़ेगा।
उदाहरण के लिए, एमजीआई प्लेटफॉर्म के बबल एडाप्टर में एक विशेष द्वितीयक संरचना होती है और टी4 डीएनए लाइगेज के लिए बहुत उच्च बंधन दक्षता की आवश्यकता होती है, और बंधन दक्षता में कमी सीधे लाइब्रेरी के आउटपुट को प्रभावित करती है।

चित्र 4. सामान्य एडाप्टर लिगेशन प्रक्रिया

3.येसेन बायोटेक टी4 डीएनए लाइगेज का उपयोग एनजीएस एडाप्टर लाइगेशन के लिए किया जा सकता है

येसेन बायोटेक द्वारा विशेष रूप से विकसित फास्ट टी4 डीएनए लाइगेज एनजीएस लाइब्रेरी निर्माण की प्रक्रिया में डीएनए टुकड़ों और एडेप्टर के बंधन के लिए। एंजाइम में कुशल बंधन क्षमता है, न केवल तेज़ कनेक्शन गति बल्कि विभिन्न प्रकार के नमूनों के साथ संगत भी है, जो जटिल संरचनाओं के साथ न्यूक्लिक एसिड टुकड़ों के कनेक्शन के लिए अधिक फायदेमंद है। वर्तमान में, यह बड़ी संख्या में ग्राहकों के उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण द्वारा सत्यापित किया गया है। एमजीआई प्लेटफॉर्म पर बबल एडेप्टर के कनेक्शन के लिए, उत्कृष्ट अनुक्रमण गुणवत्ता भी प्राप्त की जा सकती है।

3.1 येसेन बायोटेक फास्ट टी4 डीएनए लाइगेज अल्ट्रा-हाई लिगेशन दक्षता के साथ

येसेन बायोटेक फास्ट टी4 डीएनए लाइगेज का उपयोग विभिन्न एडाप्टर प्रकारों के साथ लाइब्रेरी बनाने के लिए करें। नमूना 170 बीपी सीएफडीएनए नकल है, और परिणामों का पता लगाने के लिए एजिलेंट 2100 लाइब्रेरी का उपयोग किया जाता है। ①अनकनेक्टेड एडाप्टर उत्पाद; ②सिंगल-एंड एडाप्टर उत्पाद; ③डबल-एंड एडाप्टर उत्पाद; ④अवशिष्ट एडाप्टर। परिणामों से, यह देखा जा सकता है कि सिंगल-एंडेड और डबल-एंडेड एडाप्टर की लाइगेशन दक्षता बहुत अधिक है।

चित्र 5. एजिलेंट 2100 द्वारा पता लगाए गए विभिन्न प्रकार के लिगेशन उत्पाद

3.2 येसेन बायोटेक फास्ट टी4 डीएनए लाइगेज उत्कृष्ट लाइब्रेरी उपज के साथ

विभिन्न प्रकार के लाइब्रेरी निर्माण के लिए फास्ट टी4 डीएनए लाइगेज का उपयोग करने से, अन्य टी4 डीएनए लाइगेज की तुलना में, लाइब्रेरी परिणाम बेहतर होते हैं।

तालिका 1. पुस्तकालयों द्वारा विभिन्न प्रकार के नमूने प्राप्त करना

4. येसेन बायोटेक टी4 डीएनए लाइगेज के लिए चयन गाइड

येसेन एक बायोटेक्नोलॉजी कंपनी है जो तीन प्रमुख जैविक अभिकर्मकों: अणुओं, प्रोटीन और कोशिकाओं के अनुसंधान, विकास, उत्पादन और बिक्री में लगी हुई है। फास्ट टी4 डीएनए लाइगेज के अलावा, येसेन बायोटेक के पास भी है नवीन T4 डीएनए लाइगेज और त्वरित T4 डीएनए लाइगेज चुनने के लिए। आप उन्हें निम्न तालिका में प्रदर्शित अनुप्रयोगों के आधार पर चुन सकते हैं:

तालिका 2: संबंधित उत्पाद

संदर्भ

[1] डब्ल्यू. युआन. जीन इंजीनियरिंग[एम]. केमिकल इंडस्ट्री प्रेस, 2019.
[2] क्लार्क डीपी, पाज़्डर्निक एनजे, मैकगी एम आर. सिंथेटिक बायोलॉजी के लिए क्लोनिंग जीन - साइंसडायरेक्ट[जे]। आणविक जीवविज्ञान (तीसरा संस्करण), 2019:199-239।
[3] टॉमकिंसन एई, विजयकुमार एस, पास्कल जेएम, एट अल. डीएनए लिगेस: संरचना, प्रतिक्रिया तंत्र और कार्य[जे]। केमिकल रिव्यू, 2006, 106(2):687-699।
[4] शुमन एस. डीएनए लिगेस: प्रगति और संभावनाएँ[जे]. जर्नल ऑफ बायोलॉजिकल केमिस्ट्री, 2009, 284(26):17365-17369.