येसेन की अभूतपूर्व उपलब्धि और मोलफ्यूचर बायोटेक्नोलॉजी
जैव प्रौद्योगिकी के तेजी से विकास के साथ, एक उभरती हुई उपचार पद्धति के रूप में mRNA थेरेपी ने अपनी मजबूत प्रोग्रामेबिलिटी और तेज प्रतिक्रिया गति के कारण बहुत ध्यान आकर्षित किया है। mRNA वैक्सीन और जीन थेरेपी जैसे क्षेत्रों में, उच्च गुणवत्ता वाले mRNA का कुशल संश्लेषण चिकित्सीय लक्ष्यों को प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कदम है। इस प्रक्रिया में, T7 RNA पॉलीमरेज़ एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, क्योंकि यह mRNA के इन विट्रो संश्लेषण को कुशलतापूर्वक उत्प्रेरित कर सकता है।
टी7 आरएनए पॉलीमरेज़ का डीएसआरएनए उपोत्पाद मुद्दा
यद्यपि T7 RNA पॉलीमरेज़ mRNA संश्लेषण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, लेकिन वास्तविक संचालन अक्सर एक उपोत्पाद के रूप में डबल-स्ट्रैंडेड RNA (dsRNA) के उत्पादन में परिणत होता है। dsRNA की उपस्थिति न केवल mRNA की उपज और शुद्धता को कम करती है, बल्कि गैर-विशिष्ट प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को भी ट्रिगर कर सकती है, जिससे प्रभावकारिता और सुरक्षा प्रभावित होती है। इसलिए, dsRNA के उत्पादन को कम करना उद्योग में एक तत्काल आवश्यकता बन गई है। वर्तमान में, dsRNA को कम करने के तरीकों में मुख्य रूप से प्रतिक्रिया स्थितियों को अनुकूलित करना और सहायक एंजाइमों का उपयोग करना शामिल है। हालाँकि ये तरीके कुछ हद तक dsRNA के उत्पादन को कम कर सकते हैं, लेकिन वे अक्सर जटिल संचालन और बढ़ी हुई लागत जैसे मुद्दों के साथ आते हैं।
हमें टी7 आरएनए पॉलीमरेज़ इंजीनियरिंग क्यों करनी चाहिए?
डीएसआरएनए उत्पादन को कम करने के लिए टी7 आरएनए पोलीमरेज़ को सीधे संशोधित करना एक अधिक मौलिक समाधान है। एंजाइम-निर्देशित विकास तकनीक एंजाइम के अमीनो एसिड अनुक्रम या संरचना को सटीक रूप से बदलकर इसके उत्प्रेरक गुणों में सुधार कर सकती है और उत्पादों की शुद्धता और उपज को बढ़ा सकती है। टी7 आरएनए पोलीमरेज़ के लिए, लक्षित संशोधन न केवल डीएसआरएनए उत्पादन को कम कर सकता है बल्कि एमआरएनए संश्लेषण की समग्र दक्षता और गुणवत्ता को भी बढ़ा सकता है।
mRNA इन विट्रो संश्लेषण कच्चे माल के आपूर्तिकर्ता के रूप में, येसेन जैव प्रौद्योगिकी, और इसकी सहायक कंपनी मोलफ्यूचर जैव प्रौद्योगिकी, पास होना ज़ाइमएडिटर निर्देशित विकास मंच का उपयोग करके एक नया T7 RNA पॉलीमरेज़ विकसित किया गया। इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रियाओं के दौरान dsRNA जैसे उप-उत्पादों के उत्पादन को कम करने के लिए, विकास टीम ने तर्कसंगत डिज़ाइन और निर्देशित स्क्रीनिंग के संयोजन के माध्यम से T7 RNA पॉलीमरेज़ को इंजीनियर किया है।
डीएसआरएनए कैसे उत्पन्न होता है?
साहित्य रिपोर्टों के अनुसार, उपोत्पाद dsRNA का उत्पादन मुख्य रूप से दो स्रोतों से होता है (चित्र 1): पहला, प्रतिलेखन के प्रारंभिक चरणों में आरंभिक संरचना से बढ़ाव संरचना में T7 RNA पोलीमरेज़ के संक्रमण के दौरान होता है, प्रतिलेखन त्रिक परिसर पृथक्करण के लिए प्रवण होता है [1], जिसके परिणामस्वरूप सिस्टम में लगभग 20 nt लंबाई वाली बड़ी संख्या में छोटी RNA श्रृंखलाएँ (अपूर्ण RNA) निकलती हैं। ये RNA श्रृंखलाएँ "प्राइमर" के रूप में कार्य करती हैं, लंबी RNA श्रृंखलाओं के साथ पूरक युग्मन करती हैं, और T7 RNA पोलीमरेज़ की RNA-निर्भर RNA पोलीमरेज़ गतिविधि (RDRP गतिविधि) [2,3] की क्रिया के तहत dsRNA का उत्पादन करने के लिए विस्तारित होती हैं। दूसरा स्रोत T7 RNA पोलीमरेज़ द्वारा धारण की गई टर्मिनल राइबोन्यूक्लियोटाइड स्थानांतरण गतिविधि द्वारा ट्रिगर किया जाता है। जब प्रतिलेखन प्रतिक्रिया रैखिक टेम्पलेट के अंत तक पहुँचती है, तो T7 RNA पोलीमरेज़ टेम्पलेट निर्भरता के बिना कई राइबोन्यूक्लियोटाइड को बेतरतीब ढंग से जोड़ सकता है। ये राइबोन्यूक्लियोटाइड, "यादृच्छिक प्राइमर" बनाते हुए, रिवर्स-फोल्ड हो सकते हैं और लक्ष्य mRNA क्षेत्र के साथ पूरक रूप से युग्मित हो सकते हैं, जिससे dsRNA का उत्पादन होता है। लूपिंग के माध्यम से उत्पादित dsRNA को लूपबैक dsRNA [3,4] कहा जाता है। इसलिए, dsRNA उपोत्पादों को कम करने के लिए, T7 RNA पोलीमरेज़ संशोधन का ध्यान प्रारंभिक प्रतिलेखन त्रिगुट परिसर को स्थिर करने या टर्मिनल स्थानांतरण गतिविधि और RNA आश्रित RNA पोलीमरेज़ (RDRP) को कमज़ोर करने पर है। टी7 आरएनए पोलीमरेज़ की गतिविधि।
चित्र 1. ऊर्जा अवरोध और dsRNA गठन सिद्धांत का योजनाबद्ध आरेख (अप्रकाशित डेटा)
कैसे काबू पाएं? ऊर्जा अवरोध टी7 आरएनए पॉलीमरेज़ का संरचनात्मक संक्रमण?
संरचनात्मक और मुक्त ऊर्जा विश्लेषण के माध्यम से, टीम ने एक तरफ यह पाया कि T7 RNA पॉलीमरेज़ के संरचनात्मक परिवर्तनों के साथ-साथ ऊर्जा में भी बदलाव होता है। विस्तार संरचना की मुक्त ऊर्जा आरंभ संरचना की तुलना में काफी अधिक है, जो दर्शाता है कि प्रतिलेखन प्रक्रिया को पूर्ण mRNA श्रृंखलाओं का उत्पादन करने के लिए उच्च ऊर्जा अवरोध को दूर करने की आवश्यकता है। एक उच्च ऊर्जा अवरोध सुचारू संरचनात्मक संक्रमण के लिए प्रतिकूल है। इसलिए, टीम ने इसका उपयोग किया तर्कसंगत 20 से अधिक हॉटस्पॉट अमीनो एसिड की पहचान करने के लिए स्क्रीनिंग विधियों का उपयोग किया गया तथा संबंधित संतृप्ति उत्परिवर्तन लाइब्रेरी का निर्माण किया गया।
इसे कैसे संशोधित करें? टी7 आरएनए पॉलीमरेज़ की टर्मिनल ट्रांसफर और आरडीआरपी गतिविधियाँ
दूसरी ओर, T7 RNA पॉलीमरेज़ के टर्मिनल ट्रांसफ़र और RDRP गतिविधियों से संबंधित कार्यों, साइटों और संरचनात्मक डोमेन पर सीमित रिपोर्टों पर विचार करते हुए, और क्योंकि ये दो गतिविधियाँ, जो कार्यात्मक रूप से समान हैं, संभवतः T7 RNA पॉलीमरेज़ की मुख्य प्रतिक्रिया के साथ प्रमुख साइटों को साझा करती हैं - प्रतिलेखन गतिविधि (यानी, DNA-निर्भर RNA पॉलीमराइज़ेशन गतिविधि, DDRP) - साइट-निर्देशित संशोधन के लिए हॉटस्पॉट अमीनो एसिड ढूंढना मुश्किल है। इसलिए, टीम ने एक साथ त्रुटि-प्रवण PCR पर आधारित कई यादृच्छिक उत्परिवर्तन पुस्तकालयों का निर्माण किया, जो ZymeEditor प्लेटफ़ॉर्म की उच्च-थ्रूपुट विकास क्षमता के साथ संयुक्त है, जिसके परिणामस्वरूप प्रत्येक व्यक्तिगत पुस्तकालय के लिए 10^6 से अधिक विविधता है।
आदर्श की जांच आधारित खोज टी7 आरएनए पॉलीमरेज़
टी7 आरएनए पॉलीमरेज़ के उत्पादन को संतुलित करने और इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में डीएसआरएनए की सामग्री की निगरानी करने के लिए, टीम ने अनुकूलित प्रतिलेखन टेम्पलेट्स के संदर्भ में, कई फ्लोरोसेंट को सावधानीपूर्वक डिज़ाइन किया लक्ष्य mRNA उत्पादों के विभिन्न क्षेत्रों को लक्षित करने वाली जांच। ये जांच प्रणाली के भीतर प्रतिक्रिया उपज, अखंडता और dsRNA सामग्री जैसी जानकारी को प्रतिदीप्ति संकेतों के साथ जोड़ती हैं। प्रणाली की प्रतिदीप्ति तीव्रता जितनी मजबूत होगी, म्यूटेंट का प्रदर्शन उतना ही अधिक फायदेमंद होगा। सिद्धांत रूप में, यह स्क्रीनिंग विधि विभिन्न जांचों की प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर म्यूटेंट को रैंक कर सकती है, उच्च उपज या कम गर्भपात RNA के साथ T7 RNA पोलीमरेज़ म्यूटेंट प्राप्त कर सकती है, साथ ही बेहतर अखंडता या कम लूपबैक dsRNA वाले म्यूटेंट भी प्राप्त कर सकती है। जब प्रतिक्रिया टेम्पलेट को RNA से बदल दिया जाता है, तो कम RDRP गतिविधि वाले म्यूटेंट को भी नकारात्मक रूप से जांचा जा सकता है, जिससे T7 RNA पोलीमरेज़ की टेम्पलेट चयनात्मकता में सुधार होता है। इसके अतिरिक्त, संशोधित न्यूक्लियोटाइड, कैप एनालॉग्स को जोड़कर और ड्रॉपलेट प्रतिक्रिया प्रणाली में प्रतिक्रिया तापमान को बढ़ाकर, T7 RNA पोलीमरेज़ म्यूटेंट का चयन करने के लिए आगे की स्क्रीनिंग की जा सकती है जो गैर-प्राकृतिक सब्सट्रेट को सहन करते हैं और बेहतर थर्मल स्थिरता प्रदर्शित करते हैं।
सर्वोत्तम स्क्रीनिंग कैसे करें टी7 आरएनए पॉलीमरेज़?
पुस्तकालयों के आकार के आधार पर, टीम ने फ्लोरोसेंस-एक्टिवेटेड ड्रॉपलेट सॉर्टिंग (एफएडीएस) पर आधारित अल्ट्रा-हाई-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रक्रियाएं और पारंपरिक माइक्रोप्लेट विधियों (एमटीपीएस) पर आधारित उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्रक्रियाएं विकसित की गईं।प्रयोगों के कई दौरों के माध्यम से, कुल मिलाकर 10^7 से अधिक म्यूटेंट की जांच की गई, जिसके परिणामस्वरूप कई म्यूटेंट में काफी कम dsRNA सामग्री पाई गई। उनमें से, कुछ म्यूटेंट ने प्रतिक्रिया में गर्भपात RNA के कारण dsRNA में कमी दिखाई, जो यह दर्शाता है कि इन पॉलीमरेज़ म्यूटेंट की बढ़ाव संरचना अधिक स्थिर है। कुछ म्यूटेंट ने प्रतिक्रिया में लूपबैक dsRNA सामग्री में कमी दिखाई, जो इन म्यूटेंट में टर्मिनल ट्रांसफर गतिविधि या RDRP गतिविधि के कमजोर होने का संकेत देता है।
यह देखते हुए कि उपर्युक्त उत्परिवर्ती के प्रदर्शन लाभ विभिन्न तंत्रों से उत्पन्न होते हैं, टीम उन्हें लक्ष्य करके डीएनए शफलिंग लाइब्रेरी का निर्माण किया है। स्क्रीनिंग के बाद, टीम अंततः बेहतर प्रदर्शन करने वाले म्यूटेंट प्राप्त हुए अत्यंत कम dsRNA उत्पादन के साथ, जबकि पैदावार और mRNA अखंडता को प्रभावित नहीं करता (चित्र 2)। हालाँकि, मॉडर्ना द्वारा खोजे गए उत्परिवर्ती G47A+884G की पैदावार प्रभावित हुई थी[5] (अप्रकाशित)
चित्र 2. एंजाइम विकास प्रक्रिया और उत्परिवर्ती प्रदर्शन का लक्षण वर्णन
(अप्रकाशित)
डीएसआरएनए पीढ़ी का विश्लेषण टी7 आरएनए पॉलीमरेज़ वेरिएंट?
मात्रात्मक विश्लेषण के बाद, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, सह-प्रतिलेखन कैपिंग स्थितियों के तहत 9 केबी प्रतिलेखन टेम्पलेट का उपयोग करते हुए, जंगली-प्रकार टी 7 आरएनए पोलीमरेज़ ने प्राकृतिक न्यूक्लियोटाइड का उपयोग करते समय लगभग 2.9 एनजी / माइक्रोग्राम डीएसआरएनए का उत्पादन किया, जबकि एक वाणिज्यिक टी7 एंजाइम लगभग 0.18 ng/μg dsRNA का उत्पादन किया। हालाँकि, प्रत्येक T7 RNA पॉलीमरेज़ वैरिएंट का dsRNA उत्पादन निर्मित 0.10 ng/μg से कम था। विशेष रूप से, एक प्रकार केवल 0.015 ng/μg था, जो जंगली प्रकार से लगभग 200 गुना कम और वाणिज्यिक प्रकार से 12 गुना कम था। उत्पाद। बार-बार परीक्षण के बाद, विभिन्न प्रतिक्रिया स्थितियों के तहत डीएसआरएनए को कम करने में वेरिएंट का प्रदर्शन लाभ लगातार देखा गया, जो इन म्यूटेंट की अच्छी प्रणाली संगतता को दर्शाता है और प्रतिक्रिया बफर के माध्यम से डीएसआरएनए उत्पादन को और कम करने के लिए आधार तैयार करता है। अनुकूलन। इसके अलावा, FADS स्क्रीनिंग ने बेहतर उत्पाद अखंडता और थर्मल स्थिरता के साथ कई वेरिएंट भी प्राप्त किए, जो इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला की आवश्यकताओं को पूरा कर सकते हैं
चित्र 3. येसेन डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए (डीएसआरएनए) एलिसा किट और जे2 एंटीबॉडी डॉट ब्लॉट विश्लेषण का उपयोग करके टी7 आरएनए पॉलीमरेज़ वेरिएंट द्वारा डीएसआरएनए पीढ़ी का मूल्यांकन।
वर्तमान में, कई साझेदार पहले ही टी7 आरएनए पॉलीमरेज़ वेरिएंट का प्रयास कर चुके हैं और हमें उनसे काफी प्रशंसा मिली है। नए एंजाइम के उपयोग से mRNA शुद्धिकरण प्रक्रिया सरल हो जाती है, कार्य कुशलता बढ़ जाती है, तथा बहु अनुप्रयोग परिदृश्यों में उत्कृष्ट प्रदर्शन प्रदर्शित होता है।
मोलफ्यूचर बायोटेक्नोलॉजी के बारे में
मोलफ्यूचर बायोटेक्नोलॉजी येसेन की सहायक कंपनी है बायोटेक्नोलॉजी (शंघाई) कंपनी लिमिटेड, एंजाइम विकास प्रौद्योगिकी द्वारा संचालित अनुकूलित एंजाइम संशोधन समाधान प्रदान करने में विशेषज्ञता रखती है।येसेन के संसाधनों का लाभ उठाना बायोटेक्नोलॉजी, मोलफ्यूचर छह प्रमुख तकनीकी प्लेटफ़ॉर्म पर काम करता है: ज़ाइमएडिटर अभिनव एंजाइम विकास प्लेटफ़ॉर्म, एक मल्टी-होस्ट उच्च दक्षता अभिव्यक्ति प्लेटफ़ॉर्म, किण्वन प्रक्रिया विकास प्लेटफ़ॉर्म, शुद्धिकरण प्रक्रिया विकास प्लेटफ़ॉर्म, अल्ट्रा-क्लीन एंजाइम उत्पादन प्लेटफ़ॉर्म, और एंजाइम विश्लेषण और गुणवत्ता नियंत्रण प्लेटफ़ॉर्म। इन छह तकनीकी प्लेटफ़ॉर्म के साथ, मोलफ्यूचर इन विट्रो डायग्नोस्टिक्स, बायोमेडिसिन, सिंथेटिक बायोलॉजी, मेडिकल एस्थेटिक्स, फार्मास्युटिकल इंटरमीडिएट्स, आदि जैसे क्षेत्रों में एंजाइमों की एप्लिकेशन मांगों को पूरा करने के लिए एंजाइम-निर्देशित विकास, नए एंजाइम विकास, एंजाइम प्रक्रिया विकास और जीएमपी-स्तरीय स्केल-अप उत्पादन सहित अनुकूलित समाधानों का एक पूरा सेट पेश कर सकता है।
आदेश की जानकारी
येसेन द्वारा प्रस्तुत प्रतिनिधि उत्पाद निम्नलिखित हैं। अतिरिक्त आकार उपलब्ध हैं। हमारे उत्पाद बेहतरीन प्रदर्शन और पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने में मदद करने के लिए मिलकर काम करने के लिए अत्यधिक अनुकूलित हैं। हम अनुकूलित सेवाएँ भी प्रदान कर सकते हैं। यदि आप किसी ऐसे उत्पाद में रुचि रखते हैं जो दिखाया नहीं गया है, तो हमसे संपर्क करें और हम आपकी ज़रूरतों को पूरा करने के लिए आपके साथ काम करेंगे।
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