DSRNA का पता लगाने के मानकीकरण को बढ़ावा देने के लिए डबल-फंसे हुए RNA (DSRNA) एलिसा किट की सत्यापन रिपोर्ट साझा करना।

क्या आप इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन में mRNA के दौरान अवशिष्ट dsRNA का पता लगाने का कोई विश्वसनीय तरीका खोज रहे हैं? डबल-स्ट्रैंडेड RNA (dsRNA) ELISA किट से बेहतर कोई विकल्प नहीं है। हालाँकि, कई व्यावसायिक किट उपलब्ध होने के कारण, यह ध्यान रखना ज़रूरी है कि सत्यापन डेटा हमेशा सार्वजनिक रूप से उपलब्ध नहीं हो सकता है, जिससे dsRNA का पता लगाने में असंगति हो सकती है। इसलिए हम डबल-स्ट्रैंडेड RNA (dsRNA) ELISA किट की अपनी सत्यापन रिपोर्ट साझा कर रहे हैं, जिसमें विशिष्टता, सटीकता, सटीकता, संवेदनशीलता और स्थायित्व को शामिल किया गया है। यह रिपोर्ट विशिष्ट प्रायोगिक स्थितियों और विनियामक फार्माकोपियल मानकों के अनुरूप dsRNA अवशिष्ट पता लगाने के तरीकों को मान्य करने के लिए एक संदर्भ मार्गदर्शिका के रूप में कार्य करती है। कृपया हमारी सत्यापन रिपोर्ट के बारे में अधिक जानें डीएसआरएनए पहचान के मानकीकरण को बढ़ावा देना।

डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए (डीएसआरएनए) एलिसा कयह

पृष्ठभूमि:

डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए (डीएसआरएनए) एलिसा किट एक अभिकर्मक किट है जिसे इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया में mRNA के दौरान उत्पादित अवशिष्ट डीएसआरएनए का पता लगाने के लिए डिज़ाइन किया गया है। डबल एंटीबॉडी सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट एसे (एलिसा) और बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन एम्पलीफिकेशन सिस्टम के प्रायोगिक सिद्धांत को लागू करते हुए, यह किट नमूनों में अवशिष्ट डीएसआरएनए का संवेदनशील पता लगाने की सुविधा प्रदान करता है।

सारांश डेटा में विशिष्टता, परिशुद्धता, सटीकता, संवेदनशीलता और स्थायित्व को कवर करने वाले सत्यापन पैरामीटर शामिल हैं। रिपोर्ट एक संदर्भ मार्गदर्शिका के रूप में कार्य करती है, जो उपयोगकर्ताओं को उनकी विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों के अनुरूप dsRNA अवशिष्ट पहचान विधियों को मान्य करने और नियामक फार्माकोपियल मानकों का पालन करने का आग्रह करती है।

सामग्री और तरीके:

किट: डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए (डीएसआरएनए) एलिसा किट: कैट#36717ईएस (येसेन)किट में चार अलग-अलग प्रकार के dsRNA मानक नमूने शामिल हैं। उपयोगकर्ताओं के पास मानक नमूना प्रकार चुनने का विकल्प होता है जो मानक वक्र बनाने के लिए उनकी विशिष्ट प्रक्रिया के साथ संरेखित होता है, जिससे सभी नमूनों को तैयार करने और उनका परीक्षण करने की आवश्यकता से बचा जा सकता है।

विधियाँ: प्रयोग के लिए आवश्यक सामग्री और प्रक्रियात्मक चरण मुख्य रूप से येसेन बायोटेक्नोलॉजी द्वारा निर्दिष्ट किए गए हैं। किट का व्यापक परीक्षण और मूल्यांकन किया गया है, जिससे यह सुनिश्चित होता है कि इसका प्रदर्शन ICH Q2(R1) और चीनी फार्माकोपिया भाग चार "9101 विश्लेषणात्मक विधि सत्यापन दिशानिर्देश" के 2020 संस्करण की निर्धारित आवश्यकताओं को पूरा करता है।

परिणाम

1. डीएसआरएनए मानकों की रैखिकता

इस रिपोर्ट में सभी चार अलग-अलग प्रकार के dsRNA मानकों के लिए मानक वक्र विकसित किए गए हैं, जिनमें से प्रत्येक की लंबाई 300bp है। इन मानकों में STD1, असंशोधित dsRNA; STD2, स्यूडो-UTP संशोधित dsRNA; STD3, N1-Me-स्यूडो-UTP संशोधित dsRNA; और STD4, 5-OMe-UTP संशोधित dsRNA शामिल हैं। प्रत्येक प्रकार का dsRNA मानक R2 > 0.99 के साथ तनुकरण की उत्कृष्ट रैखिकता प्रदर्शित करता है और मापी गई सांद्रता का भिन्नता गुणांक (CV) 10% से कम है, जैसा कि तालिका 1 से तालिका 5 में दिखाया गया है।

एसटीडी नाम	यूटीपी प्रकार	तनुकरण की रैखिकता (आर2＞0.99)	सीवी
एसटीडी1	यूटीपी	0.0156-1 पीजी/μL	＜10%
एसटीडी2	pUTP	0.0156-1 पीजी/μL	＜10%
एसटीडी3	N1-मी-pUTP	0.0312-1 पीजी/μL	＜10%
एसटीडी4	5-ओएमई-यूटीपी	0.0625-1 पीजी/μL	＜10%

तालिका 1. विभिन्न dsRNA मानकों की रैखिकता।

तालिका 2.रिकवरी और सी.वी. पतला STD1 का

STD2 सांद्रएन. (पीजी/μL)	मापा गया माध्य (पीजी/μL)	वसूली	सीवी
1	1.0001	100.0%	0.7%
0.5	0.4994	99.9%	0.1%
0.25	0.2514	100.6%	0.9%
0.125	0.1232	98.6%	2.5%
0.0625	0.0635	101.6%	1.1%
0.0312	0.0312	99.9%	0.5%
0.0156	0.0155	99.6%	0.0%
0	/	/	/

तालिका 3. रिकवरी और सी.वी. पतला STD2 का

STD3 संबंध (पीजी/μL)	मापा गया माध्य (पीजी/μL)	वसूली	सीवी
2	2.0031	100.2%	1.6%
1	0.9880	98.8%	2.4%
0.5	0.5188	103.8%	1.2%
0.25	0.2383	95.3%	2.2%
0.125	0.1242	99.4%	0.1%
0.0625	0.0629	100.7%	1.8%
0.0312	0.0361	115.7%	1.6%
0	/	/	/

तालिका 4. रिकवरी और सी.वी. पतला STD3 का

STD4 संबंध (पीजी/μL)	मापा गया माध्य (पीजी/μL)	वसूली	सीवी
4	4.0096	100.2%	1.9%
2	1.9940	99.7%	0.7%
1	0.9977	99.8%	0.1%
0.5	0.5108	102.2%	0.1%
0.25	0.2454	98.2%	5.6%
0.125	0.1207	96.5%	2.8%
0.0625	0.0624	99.9%	0.3%
0	/	/	/

तालिका 5. रिकवरी और सी.वी. पतला STD4 का

2. विशेषता

• डीएसआरएनए, एसएसआरएनए, डीएसडीएनए और एसएसडीएनए के साथ विशिष्टता विश्लेषण।

• विशिष्टता dsRNAs की लंबाई से प्रभावित नहीं हुई।

3. एशुद्धता

0.5 pg/μL STD1 मिलाना 0.36 pg/μL की dsRNA सामग्री वाले ज्ञात mRNA नमूने पर तीन अलग-अलग वॉल्यूम अनुपातों (1:1, 1:20, 1:250) में आयोजित किया गया था। सभी मामलों में, स्पाइक रिकवरी दरें 80-120% की सीमा के भीतर गिर गईं।

स्पाइक रिकवरी दर की गणना इस प्रकार की जाती है: स्पाइक वसूली दर=(मापा एकाग्रता बाद स्पाइकिंग×कुल आयतन का नुकीला नमूना−मापा एकाग्रता का  नमूना×कुल आयतन का  नमूना)/(सैद्धांतिक एकाग्रता का  स्पाइक×वॉल्यूम का  स्पाइक)×100%

नमूने	STD1/नमूना का आयतन अनुपात	मापा गया डीएसआरएनए (पीजी/μएल)	नोकदार चीज़ वसूली दर
नमूना (टीएस)	/	0.36	/
टीएस+0.5पीजी/μएल एसटीडी1	1:1	0.769	81%
टीएस+0.5पीजी/μएल एसटीडी1	1:20	0.777	82%
टीएस+0.5पीजी/μएल एसटीडी1	1:250	0.803	82%

तालिका 6. स्पाइक रिकवरी दर विश्लेषण

4. शुद्धता

• अंतर-परख परिशुद्धता

चार डीएसआरएनए मानक नमूनों में से प्रत्येक के लिए तीन सांद्रता स्तरों (उच्च, मध्यम और निम्न) पर प्रयोग किए गए। एक ही प्रयोग में, प्रत्येक सांद्रता नमूने पर आठ बार दोहराए गए परीक्षण किए गए। परिणाम दर्शाते हैं कि भिन्नता का गुणांक (सीवी) 15% से कम है जो एक अच्छी अंतर-परख परिशुद्धता का संकेत देता है।

एसटीडी1
सैद्धांतिक संबंध (पीजी/μएल)	प्रतिकृति	मापा गया माध्य (pg/μL)	सीवी
1	8	1.0002	3.11%
0.125	8	0.1230	0.46%
0.0156	8	0.0164	3.18%
एसटीडी2
सैद्धांतिक संबंध (पीजी/μएल)	प्रतिकृति	मापा गया माध्य (pg/μL)	सीवी
1	8	1.0001	0.65%
0.125	8	0.1231	2.46%
0.0156	8	0.0162	0.02%
एसटीडी3
सैद्धांतिक संबंध (पीजी/μएल)	प्रतिकृति	मापा गया माध्य (pg/μL)	सीवी
2	8	2.0022	1.58%
0.25	8	0.2444	2.17%
0.0312	8	0.0328	1.64%
एसटीडी4
सैद्धांतिक संबंध (पीजी/μएल)	प्रतिकृति	मापा गया माध्य (pg/μL)	सीवी
8	8	8.0803	0.27%
1	8	0.9650	0.12%
0.125	8	0.1322	2.76%

तालिका 7. अंतर-परख परिशुद्धता विश्लेषण

• अंतर-परख परिशुद्धता

3 किटों का उपयोग करके तीन प्रयोग किए गए बैच। प्रत्येक प्रयोग में, उच्च, मध्यम और निम्न सांद्रता को चुना गया और चार डीएसआरएनए मानक नमूनों में से प्रत्येक के लिए तीन बार परीक्षण किया गया, जिसमें आठ प्रतिकृतियां थीं। परिणामस्वरूप, प्रत्येक पर 24 डेटा बिंदु प्राप्त किए गए सांद्रता स्तर, जिसे तब भिन्नता गुणांक (सीवी) विश्लेषण के लिए उपयोग किया गया था। परिणाम दिखाते हैं कि मानकों की प्रत्येक सांद्रता के लिए सीवी 15% से कम था।

एसटीडी1
सैद्धांतिक संबंध (पीजी/μएल)	स्वतंत्र परीक्षण/प्रतिकृति	मापा गया माध्य (pg/μL)	सीवी
1	3/8	1.0007	2.38%
0.125	3/8	0.1186	3.20%
0.0156	3/8	0.0173	1.27%
एसटीडी2
सैद्धांतिक संबंध (पीजी/μएल)	स्वतंत्र परीक्षण/प्रतिकृति	मापा गया माध्य (pg/μL)	सीवी
1	3/8	0.9987	0.09%
0.125	3/8	0.1269	1.06%
0.0156	3/8	0.0151	0.52%
एसटीडी3
सैद्धांतिक संबंध (पीजी/μएल)	स्वतंत्र परीक्षण/प्रतिकृति	मापा गया माध्य (pg/μL)	सीवी
2	3/8	2.0012	2.37%
0.25	3/8	0.2415	0.14%
0.0312	3/8	0.0330	1.81%
एसटीडी4
सैद्धांतिक संबंध (पीजी/μएल)	स्वतंत्र परीक्षण/प्रतिकृति	मापा गया माध्य (pg/μL)	सीवी
8	3/8	7.9735	1.89%
1	3/8	1.0225	0.13%
0.125	3/8	0.1227	5.63%

तालिका 8. अंतर-परख परिशुद्धता विश्लेषण

5. संवेदनशीलता

• लोद

पता लगाने की सीमा किट रिक्त मानों के माध्य में मानक विचलन का दोगुना जोड़कर निर्धारित किया जाता है। 24 रिक्त स्थानों के OD को मापकर, उनके माध्य और मानक विचलन की गणना करके, और फिर इन मानों को फिट किए गए वक्र पर लागू करके, पता लगाने की संगत सीमा प्राप्त होना।

	आयुध डिपो
डीएसआरएनए मानक	रिक्त स्थान का मतलब	एसडी रिक्त स्थान का	रिक्त स्थान का माध्य+2एसडी	लोद
एसटीडी1	0.016	0.00048	0.01696	≤0.001पीजी/μएल
एसटीडी2	0.016	0.00072	0.01744	≤0.001पीजी/μएल
एसटीडी3	0.034	0.00119	0.03638	≤0.001पीजी/μएल
एसटीडी4	0.115	0.00290	0.1208	≤0.01पीजी/μएल

तालिका 9. एलओडी विश्लेषण

• एलओक्यू

की मात्रात्मक सीमा किट मानक वक्र के निम्नतम सान्द्रण बिंदु को और भी निचले स्तर तक पतला करके स्थापित किया जाता है, जिससे निम्नतम सान्द्रण पर CV < 20% सुनिश्चित होता है, जिससे मात्रात्मक सीमा निर्धारित होती है। एलओक्यू निम्नलिखित है।

डीएसआरएनए मानक	एलओक्यू	प्रतिकृति	सीवी(%)	वसूली (%)
एसटीडी1	0.0156 पीजी/μL	24	<10%	80~120%
एसटीडी2	0.0312 पीजी/μL	24	<10%	80~120%
एसटीडी3	0.0156 पीजी/μL	24	<10%	80~120%
एसटीडी4	0.125 पीजी/μL	24	<10%	80~120%

6. डीव्यवहार्यता

• आईवीटी सामग्रियों पर हस्तक्षेप-रोधी

यह परीक्षण इसका उद्देश्य विभिन्न एंजाइमों, बफर्स ​​आदि के प्रभाव का आकलन करना था। एमआरएनए किट द्वारा डीएसआरएनए का पता लगाने पर नमूना।

टी7 आरएनए पॉलीमरेज़, आरएनएएस अवरोधक, आईपीपीए (अकार्बनिक पाइरोफॉस्फेटस), डीएनएस I, वीसीई (वैक्सीनिया कैपिंग एंजाइम), 2'-ओ-मिथाइलट्रांसफेरेज़ (एमटी), 1×आईवीटी बफर और 1एमएम सोडियम साइट्रेट की विशिष्ट सांद्रता को प्रदान किए गए mRNA नमूने में जोड़ना, और बाद में STD3 का उपयोग करना मानक वक्र तैयारी और नमूना परीक्षण दोनों के लिए, इनमें डीएसआरएनए सामग्री का पता लगाने के लिए किट की क्षमता का मूल्यांकन सक्षम किया गया नमूनों में आठ अलग-अलग एंजाइम और बफर की मौजूदगी से डीएसआरएनए की सटीक पहचान पर कोई असर नहीं पड़ा। इसके अलावा, देखी गई रिकवरी दरें 80% से 120% के बीच थीं।

आईवीटी सामग्री	डीएसआरएनए मापा गया (pg/μL)	वसूली
कोई नहीं	0.6057	100%
टी7 आरएनए पोलीमरेज़ (15μg/mL)	0.5411	89.32%
म्यूरिन आरएनेज अवरोधक (27.5μg/mL)	0.5142	84.88%
अकार्बनिक पायरोफॉस्फेटेस (IPPA 10μg/mL)	0.7132	117.7%
डीएनएसे I (13.75μg/mL)	0.6077	100.32%
वैक्सीनिया कैपिंग एंजाइम (10μg/mL)	0.6563	108.3%
2´-O-मेथिलट्रांसफेरेज़ (10μg/mL)	0.5776	95.4%
1×आईवीटी बफर	0.5003	82.6%
1 मिमी सोडियम सिट्रट	0.6251	103.2%

तालिका 11. आईवीटी सामग्रियों के साथ मिलाए गए तनु एसटीडी3 की पुनर्प्राप्ति

• तापमान घव्यवहार्यता

किटों को दोनों स्थानों पर संग्रहित किया गया 4 डिग्री सेल्सियस और 37°C 7 दिनों के बाद डीएसआरएनए मानक की सांद्रता भिन्नता का पता लगाने के लिए। परिणाम बताते हैं कि सभी भिन्नताएं 20% के भीतर हैं।

डीएसआरएनए मानक	डीएसआरएनए मापा गया (pg/μL) दिन 0	भिन्नताएं 7 दिनों के बाद 4°C पर
एसटीडी1	1	10%
एसटीडी2	1	5%
एसटीडी3	2	7%
एसटीडी4	4	11%
डीएसआरएनए मानक	डीएसआरएनए मापा गया (pg/μL)	भिन्नताएं 7 दिनों के बाद 37°C पर
एसटीडी1	1	18%
एसटीडी2	1	4%
एसटीडी3	2	5%
एसटीडी4	4	8%

तालिका 12. तापमान स्थायित्व विश्लेषण

संबंधित उत्पाद:

प्रोडक्ट का नाम	एसकेयू	विशेष विवरण
डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए (डीएसआरएनए) एलिसा किट	36717ईएस	48टी/96टी
क्लीस्क्रिप™ टी7 आरएनए पॉलीमरेज़ (कम डीएस आरएनए, 250 यू/μL)	10628ईएस	10/100 केयू
टी7 आरएनए पोलीमरेज़ जीएमपी-ग्रेड (250 यू/μएल)	10625ईएस	10/100 केयू

संबंधित पठन:

डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए (डीएसआरएनए) एलिसा किट का उपयोग, जे2 एंटीबॉडी डॉट ब्लॉटिंग विधि के साथ, कम डीएसआरएनए टी7 आरएनए पॉलीमरेज़ म्यूटेंट्स को मान्य करने के लिए किया गया था।

कम डीएसआरएनए टी7 आरएनए पॉलीमरेज़ म्यूटेंट, एमआरएनए वैक्सीन और थेरेपी विकास को सशक्त बनाना

संदर्भ:

1. आईसीएच, 2022: विश्लेषणात्मक विधि सत्यापन Q2, मसौदा संस्करण।
2. एनएमपीए, 2007: जैविक उत्पाद गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण के लिए विश्लेषणात्मक विधि सत्यापन के मूल्यांकन के सामान्य सिद्धांत
3. चीनी फार्माकोपिया आयोग (ChPC), 2020: चीनी फार्माकोपिया, भाग चार: जैविक नमूनों के लिए मात्रात्मक विश्लेषण विधियों के सत्यापन के लिए दिशानिर्देश