हाल के वर्षों में, mRNA-आधारित दवाओं ने महत्वपूर्ण ध्यान आकर्षित किया है तथा अनुसंधान का ध्यान आकर्षित किया है। टी7 आरएनएपी अपनी सरलता और उच्च उपज के साथ आरएनए संश्लेषण को उत्प्रेरित करने की क्षमता के लिए जाना जाता है इन विट्रो में निष्ठा। हालांकि, प्रतिलेखन प्रक्रिया के दौरान, T7 RNAP उप-उत्पादों का उत्पादन कर सकता है जैसे कि निष्फल लघु RNA, समय से पहले समाप्त हो चुके RNA और 3'-विस्तारित RNA, जो dsRNA के निर्माण के लिए अनुकूल परिस्थितियाँ बनाता है। इसलिए, व्यावहारिक अनुप्रयोगों में dsRNA के उत्पादन को कम करना एक तत्काल आवश्यकता बन गई है।
हाल ही में, "एफएडीएस और अर्ध-तर्कसंगत डिजाइन संशोधित टी7 आरएनए पॉलीमरेज़ ने डीएसआरएनए उत्पादन को कम कर दिया, टर्मिनल ट्रांसफ़ेरेस और आरडीआरपी गतिविधियों को कम किया" को येसेन और मोलफ्यूचर टीम द्वारा ऑनलाइन प्रकाशित किया गया था। शोधकर्ताओं ने सफलतापूर्वक टी7 आरएनएपी को प्रतिलेखन के दौरान डीएसआरएनए उपोत्पादों के उत्पादन को कम करने के लिए इंजीनियर किया, निर्देशित विकास और अर्ध-तर्कसंगत डिजाइन के संयोजन के माध्यम से इसे जंगली-प्रकार एंजाइम के 1.8% तक कम कर दिया।
T7 RNAP की FADS-आधारित स्क्रीनिंग
टी7 आरएनएपी की जांच के लिए, प्रोटीन विकास की उच्च-थ्रूपुट आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए एफएडीएस (फ्लोरोसेंस-एक्टिवेटेड ड्रॉपलेट सॉर्टिंग) को चुना गया था। कोशिकाओं के समय से पहले विखंडन को रोकने के लिए, शोधकर्ताओं ने दोहरे जलीय चरणों के साथ एक पीडीएमएस चिप का उपयोग किया, जहां चिप पर कोशिकाओं के साथ लाइसोजाइम मिलाया गया और बूंदों के भीतर अपनी गतिविधि को लागू किया गया आकृति 1शोधकर्ताओं ने 10 से लेकर 150 तक की विविधता वाले कई यादृच्छिक उत्परिवर्ती पुस्तकालय तैयार किए।5 10 तक6स्क्रीनिंग के बाद, 10 प्रमुख वेरिएंट की पहचान की गई और उन्हें Mut1 से Mut10 के रूप में नामित किया गया। जैसा कि दिखाया गया है चित्र 2ई और चित्र 2एफ, Mut1, Mut7, और Mut9 की dsRNA सामग्री जंगली प्रकार की तुलना में काफी कम थी
चित्र 1. एफएडीएस का अवलोकन
चित्र 2. रैंडम लाइब्रेरी स्क्रीनिंग और वेरिएंट मूल्यांकन
टी7 आरएनएपी का अर्ध-तर्कसंगत डिजाइन
शोधकर्ताओं एक अर्ध-तर्कसंगत डिजाइन अन्वेषण का आयोजन किया, दस एकल-साइट संतृप्त पुस्तकालयों का निर्माण किया और स्क्रीनिंग के लिए पारंपरिक माइक्रोटिटर प्लेट-आधारित दोहरी जांच पद्धति का उपयोग किया(चित्र तीन) जोड़ा गया 5'-अंत जांच आरएनए उपज का पता लगाने के लिए नियोजित किया जाता है।
चित्र 3. घटी हुई dsRNA के लिए संरचना-निर्देशित अर्ध-तर्कसंगत डिज़ाइन
1000 से अधिक म्यूटेंट की जांच के बाद, शोधकर्ताओं ने छह उम्मीदवारों की पहचान की गई: Mut11 (K180E), Mut12 (S228F), Mut13 (G238L), Mut14 (A70Q), Mut15 (A383H), और Mut16 (I743L)। सभी छह म्यूटेंट की कुल RNA उपज जंगली-प्रकार से काफी भिन्न नहीं थी, जो तुलनीय समग्र प्रतिलेखन दक्षता का संकेत देती है। उम्मीद के मुताबिक, Mut11 और Mut14 की dsRNA सामग्री जंगली-प्रकार की तुलना में काफी कम थी(चित्र 4).
चित्र 4. माइक्रोटिटर प्लेट स्क्रीनिंग और वैरिएंट मूल्यांकन
डीएनए शफलिंग से Mut17 कम dsRNA उत्पन्न करता है
टी7 आरएनएपी को और अधिक अनुकूलित करने के लिए, उत्पादन आवश्यकताओं को पूरा करते हुए कम डीएसआरएनए सामग्री वाले चार वेरिएंट का चयन किया गया।शोधकर्ताओं ने फिर एक डीएनए शफलिंग लाइब्रेरी बनाई और माइक्रोटिटर प्लेटों से जांच की, एक ऐसे वेरिएंट की पहचान की जिसने अपने पैतृक T7 RNAP की तुलना में कम dsRNA उत्पादन प्रदर्शित किया, जिसका नाम Mut17 (A70Q/F162S/K180E) रखा गया। इसके बाद उन्होंने Mut17 और उसके पैतृक वेरिएंट (Mut14, Mut11, और Mut7) के ट्रांसक्रिप्शनल उत्पादों का विश्लेषण किया। जैसा कि दिखाया गया है चित्र 5, सभी चार वेरिएंट ने वाइल्ड-टाइप की तुलना में ट्रांसक्रिप्शन के दौरान dsRNA उत्पादन में महत्वपूर्ण कमी दिखाई। उल्लेखनीय रूप से, Mut17 ने स्क्रीनिंग की विलायक प्रणाली में केवल 1.80% की महत्वपूर्ण रूप से कम dsRNA सामग्री और 0.007 ng/μg जितनी कम मात्रा दिखाई।
चित्र 5. Mut17 की dsRNA सामग्री और इसके पैतृक उत्परिवर्तन
उत्परिवर्ती से प्राप्त IVT उत्पाद की प्रतिरक्षाजनकता, जंगली प्रकार की तुलना में काफी कम है।
अगला, हमने म्यूरिन आरए में आईवीटी उत्पादों की प्रतिरक्षाजनकता का मूल्यांकन कियाW264.7 कोशिकाएं। जैसा कि चित्र 2A और 2B में दिखाया गया है, RA में IFN-β mRNA और प्रोटीन का स्तर कम हो गया थाW264.7 कोशिकाओं को म्यूटेंट द्वारा उत्पादित mRNA से संक्रमित किया गया, जिसकी तुलना वाइल्ड-टाइप से की गई, जिससे यह संकेत मिलता है कि वाइल्ड-टाइप T7 RNA द्वारा संश्लेषित mRNA ने सबसे मजबूत प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न की, जबकि म्यूटेंट से प्राप्त mRNA ने काफी कम प्रतिक्रिया दिखाई। विशेष रूप से, Mut11 RNA द्वारा उपचारित कोशिकाओं का IFN-β mRNA जंगली-प्रकार उपचारित कोशिकाओं का केवल 9.7% था, और इसका प्रोटीन 12.93 pg/mL था। इसके अलावा, EGFP की अभिव्यक्ति ने विभिन्न T7 RNAPs द्वारा उत्पन्न mRNAs के बीच मात्रा या गुणवत्ता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया। (चित्र 6सी)औद्योगिक अनुप्रयोगों की आवश्यकताओं को पूरा करना।
चित्र 6. स्तनधारी कोशिकाओं में IFN-β प्रतिक्रिया और EGFP अभिव्यक्ति
उत्परिवर्ती की आरडीआरपी और टर्मिनल ट्रांस्फरेज गतिविधियां बहुत कम हैंहमजंगली प्रकार की तुलना में अधिक।
डीएसआरएनए को कम करने पर उत्परिवर्तन के प्रभाव की जांच करने के लिए, शोधकर्ताओं ने इन सभी उत्परिवर्तनों पर सिलिको अध्ययन किए गए। परिणाम से स्पष्ट संकेत मिलता है कि वेरिएंट में आरडीआरपी गतिविधि कम हो गई है, क्योंकि वे टेम्पलेट के रूप में आरएनए का उपयोग करने की कम प्रवृत्ति दिखाते हैं। इसी तरह, इसका टी7 आरएनएपी की टर्मिनल ट्रांसफ़ेज़ गतिविधि पर भी प्रभाव पड़ सकता है। जैसा कि दिखाया गया है आकृति 7विभिन्न सांद्रताओं के तहत, सभी 4 प्रकारों ने जंगली प्रकार की तुलना में 50% से कम प्रतिदीप्ति मूल्य प्रदर्शित किया।
इसके बाद, T7 RNAP की टर्मिनल ट्रांसफर गतिविधि को चिह्नित करने के लिए 3'-एंड हेटेरोजेनिटी परख का उपयोग किया गया। जब n>0 वाले RNA के अनुपात पर ध्यान केंद्रित किया गया, जो टर्मिनल ट्रांसफ़ेज़ गतिविधि को दर्शाता है, तो शोधकर्ताओं ने पाया गया कि जंगली प्रकार में ये आरएनए 82.94% थे, जबकि उत्परिवर्ती ने निम्नलिखित प्रतिशत प्रदर्शित किए: Mut11 (70.29%), Mut7 (67.88%), Mut14 (63.31%), और Mut17 (55.62%) (आकृति 8)महत्वपूर्ण बात यह है कि ये प्रतिशत उत्पादों में dsRNA की प्रचुरता के साथ अत्यधिक सुसंगत हैं। (चित्र 5)ये परिणाम म्यूटेंट की टर्मिनल ट्रांसफ़ेरेज़ गतिविधि में महत्वपूर्ण कमी दर्शाते हैं, जो आरडीआरपी गतिविधि में कमी के साथ मिलकर डीएसआरएनए में कमी में योगदान देता है।विशेष रूप से, टर्मिनल ट्रांसफ़ेरेज़ गतिविधि अधिक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती है, जैसा कि Mut17 में देखे गए n>0 RNAs के न्यूनतम संचयन से स्पष्ट होता है, जो सबसे कम dsRNA उत्पादन भी प्रदर्शित करता है। (चित्र 5 और चित्र 8).
आकृति 7. सापेक्ष RDRP गतिविधि
आकृति 8आरएनए उत्पादों के 3'-अंत में विविधता
निष्कर्ष
यह अध्ययन कम dsRNA सामग्री वाले उत्परिवर्ती की पहचान करने के लिए एक मजबूत पद्धति प्रदान करता है और कई dsRNA उत्परिवर्ती को सफलतापूर्वक अलग करता है जिनमें RNA-निर्भर RNA पॉलीमरेज़ और टर्मिनल ट्रांसफ़ेज़ गतिविधि कम हो गई है। यह mRNA चिकित्सा के लिए आवश्यक सुरक्षा और प्रभावकारिता के सत्यापन को काफी हद तक मजबूत करता है, mRNA टीकों और जीन थेरेपी अनुप्रयोगों को आगे बढ़ाने के लिए इसके गहन निहितार्थों को रेखांकित करता है।
इसी समय, मूल कंपनी येसेन ने एक T7 RNAP उत्पाद भी लॉन्च किया है जो dsRNA को काफी हद तक कम करता है सामग्री। कई भागीदारों ने पहले ही मोलफ्यूचर द्वारा विकसित संशोधित T7 RNAP म्यूटेंट का परीक्षण किया है और उत्पाद को ग्राहकों द्वारा अत्यधिक मान्यता दी गई है। हमारे ग्राहकों का मानना है कि नए एंजाइम के उपयोग से mRNA की शुद्धि प्रक्रिया सरल हो जाती है और IVT की प्रतिरक्षाजनकता को बहुत कम कर देता है उत्पाद, कई अनुप्रयोग परिदृश्यों में उत्कृष्ट प्रदर्शन दर्शाता है, जो बायोफार्मास्युटिकल के क्षेत्र में इसके व्यापक संभावित अनुप्रयोग को साबित करता है!
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