मेजबान सेल प्रोटीन का पता लगाने के तरीके में प्रवीणता प्राप्त करना: व्यावसायीकरण बनाम अनुकूलन की खोज

येसेन बायोटेक्नोलॉजी की कमर्शियल एचसीपी अभिकर्मक किट एचसीपी का पता लगाने के लिए एक सरल, अत्यधिक संवेदनशील और वस्तुनिष्ठ विधि है। येसेन बायोटेक्नोलॉजी ने स्वतंत्र रूप से कई अभिकर्मक किट विकसित किए हैं, जो नमूनों में अवशिष्ट एचसीपी स्तरों का संवेदनशील रूप से पता लगा सकते हैं। इन अभिकर्मक किटों का उपयोग बायोफार्मास्युटिकल्स की शुद्धिकरण प्रक्रिया को अनुकूलित करने, मध्यवर्ती प्रक्रियाओं में अशुद्धियों को नियंत्रित करने और अंतिम उत्पादों के परीक्षण को जारी करने के लिए किया जा सकता है। येसेन बायोटेक्नोलॉजी की एचसीपी अभिकर्मक किट आपके बायोफार्मास्युटिकल उत्पादन को कैसे बेहतर बना सकती हैं, इसके बारे में अधिक जानना चाहते हैं? पढ़ें अब लेख!

एचसीपी जांच की अवधारणा और आवश्यकता

जैविक उत्पाद आम तौर पर मेजबान कोशिकाओं (जैसे बैक्टीरिया, खमीर, स्तनधारी, कीट या पौधे की कोशिकाओं) में पुनः संयोजक प्रौद्योगिकी का उपयोग करके उत्पादित किए जाते हैं, जिसमें मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, पुनः संयोजक प्रोटीन और टीके शामिल हैं। इन उत्पादों के निर्माण और शुद्धिकरण की प्रक्रिया अनिवार्य रूप से मेजबान कोशिका प्रोटीन (HCP) को अशुद्धियों के रूप में पेश करती है, जिसमें मेजबान कोशिकाओं के संरचनात्मक प्रोटीन और मेजबान कोशिकाओं द्वारा स्रावित वृद्धि कारक दोनों शामिल होते हैं, जो विभिन्न भौतिक और प्रतिरक्षात्मक गुणों के साथ एक जटिल मिश्रण बनाते हैं। उन्नत शुद्धिकरण तकनीकों के उपयोग के बावजूद, कुछ मेजबान कोशिका प्रोटीन अभी भी मध्यवर्ती दवा उत्पादों में प्रक्रिया-संबंधित अशुद्धियों के रूप में रह सकते हैं।

इन अशुद्धियों में संभावित प्रतिरक्षाजन्यता होती है और ये बायोफार्मास्युटिकल उत्पादों की प्रतिरक्षाजन्य प्रतिक्रिया को बढ़ा सकती हैं, जिससे उनकी स्थिरता और प्रभावकारिता प्रभावित होती है, जिससे मानव सुरक्षा के लिए जोखिम पैदा होता है। इसलिए, एचसीपी को हटाने के लिए उचित निगरानी रणनीतियों को स्थापित करने की आवश्यकता है, और दवा की गुणवत्ता की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए अंतिम उत्पाद में एचसीपी की सामग्री को नियंत्रित करने की आवश्यकता है।

एच.सी.पी. के लिए विनियामक आवश्यकताएँ

जैविक उत्पादों में एचसीपी की अवशिष्ट सामग्री को आम तौर पर उत्पाद की एक महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषता (सीक्यूए), प्रक्रिया मजबूती निगरानी के लिए एक महत्वपूर्ण मूल्यांकन सूचकांक और उत्पाद का एक प्रमुख गुणवत्ता नियंत्रण सूचकांक माना जाता है। विभिन्न देशों में नियामक प्राधिकरणों के पास एचसीपी के संबंध में प्रावधान हैं, जिसमें मेजबान कोशिका प्रोटीन एचसीपी को स्वीकार्य स्तर तक कम करने के लिए बायोफार्मास्युटिकल्स के विश्लेषण और शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है। एचसीपी के स्वीकृति स्तर का मूल्यांकन विशिष्ट परिस्थितियों के आधार पर किया जाएगा और यह खुराक, खुराक आवृत्ति, दवा के प्रकार और रोग की गंभीरता सहित कई कारकों पर निर्भर करता है।

चीनी फार्माकोपिया (2020 संस्करण) में प्रावधान है: CHO कोशिकाओं के लिए, अवशिष्ट HCP <0.05% (500 पीपीएम से कम के बराबर) होना चाहिए; ई. कोलाई के लिए, अवशिष्ट HCP <0.01% होना चाहिए।

यूनाइटेड स्टेट्स फार्माकोपिया यूएसपी <1132> अध्याय निर्दिष्ट करता है: दवाओं में एचसीपी का पता लगाने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील विधि का उपयोग किया जाना चाहिए, और सामग्री का पता लगाने की सीमा से नीचे होना चाहिए (आमतौर पर 100 पीपीएम से कम, यानी, 1 मिलीग्राम कुल प्रोटीन में एचसीपी सामग्री 100 एनजी से कम या <0.01% होनी चाहिए)।

यूरोपीय फार्माकोपिया EP 2.6.34 निर्दिष्ट करता है: जैविक उत्पादों में, एचसीपी की मात्रा 0.1% से कम होनी चाहिए।

मानव उपयोग के लिए औषधियों के पंजीकरण हेतु तकनीकी आवश्यकताओं के समन्वय पर अंतर्राष्ट्रीय सम्मेलन (आईसीएच) के दिशा-निर्देश: आईसीएच क्यू6बी में कहा गया है कि अवशिष्ट एचसीपी की निगरानी के लिए संवेदनशील और मान्य तरीकों को अपनाया जाना चाहिए, जिसमें अवशिष्ट मात्रा आमतौर पर 100 पीपीएम से कम होनी चाहिए।

यह देखा जा सकता है कि विनियामक एजेंसियों के पास एचसीपी के लिए अत्यधिक सुसंगत आवश्यकताएं हैं। जैविक उत्पादों के प्रक्रिया विकास को एचसीपी का पता लगाना चाहिए, यह प्रदर्शित करना चाहिए कि शुद्धिकरण प्रक्रिया एचसीपी को सुरक्षित स्तर तक कम कर सकती है, और अंतिम उत्पाद में अवशिष्ट सामग्री के लिए अनुशंसित सीमा चीन और संयुक्त राज्य अमेरिका दोनों में 0.01% से कम है।

एचसीपी का पता लगाने के तरीके

एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (ELISA) वर्तमान में HCP का पता लगाने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली विधि है। चीनी फार्माकोपिया के 2020 संस्करण के अध्याय 3412/3413/3414 में उल्लिखित मेजबान प्रोटीन अवशेष का पता लगाने की सभी विधियाँ ELISA विधियाँ हैं।

यूनाइटेड स्टेट्स फार्माकोपिया यूएसपी <1132> अध्याय में यह भी उल्लेख किया गया है कि इलेक्ट्रोफोरेसिस, एलिसा और एलसी-एमएस/एमएस जैसी विधियों का उपयोग एचसीपी सामग्री का पता लगाने के लिए किया जा सकता है, और एलिसा को इसके संचालन में आसानी, गति, उच्च संवेदनशीलता और उच्च थ्रूपुट के कारण एचसीपी का पता लगाने के लिए पसंदीदा विधि के रूप में अनुशंसित किया जाता है।

एलिसा:

उद्देश्य: यह एच.सी.पी. में प्रोटीन की कुल मात्रा का पता लगाता है, इसका उपयोग उत्पाद विकास और प्रक्रिया नियंत्रण के लिए किया जा सकता है, तथा वर्तमान में यह एच.सी.पी. का पता लगाने की एक सामान्य विधि है।

लाभ: उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता; उच्च थ्रूपुट और स्वचालन क्षमता; मात्रात्मक; आसान और तेज संचालन।

नुकसान: विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है; व्यक्तिगत HCP की पहचान और मूल्यांकन नहीं किया जा सकता; विधि का विकास जटिल है, जिसके लिए विशेष एंटीजन तैयारी की आवश्यकता होती है; विधि को प्रभावित करने वाले कई कारक हैं, HCP कवरेज का मूल्यांकन किया जाना आवश्यक है; प्रजातियों की पहचान नहीं की जा सकती।

वेस्टर्न ब्लॉटिंग:

उद्देश्य: बड़ी संख्या में नमूनों की लगातार जांच करने और एंटी-एचसीपी एंटीबॉडी के साथ प्रतिक्रिया करने वाले अज्ञात प्रोटीन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है। एचसीपी का पता लगाने और एचसीपी के सापेक्ष आणविक भार पर अनुमानित जानकारी प्रदान करने के लिए उपयुक्त है।

लाभ: विशिष्टता; परिणाम दृष्टिगत रूप से सहज होते हैं: प्रोटीन के आकार और अभिव्यक्ति के स्तर में अंतर को दर्शाते हैं; विशिष्ट HCPs का पता लगा सकते हैं और उनकी मात्रा निर्धारित कर सकते हैं।

नुकसान: अर्द्ध-मात्रात्मक; विशिष्ट प्रोटीनों तक सीमित: केवल एंटीबॉडी से बंधे एचसीपी का पता लगा सकता है; जटिल प्रोटीन मिश्रणों के लिए पर्याप्त संवेदनशील नहीं; प्रोटीन एसडीएस विकृतीकरण से अनुरूपण एपिटोप्स की हानि हो सकती है; संवेदनशीलता पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी की गुणवत्ता पर निर्भर करती है।

द्वि-आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन (2-डीई):

उद्देश्य: आमतौर पर अपस्ट्रीम या डाउनस्ट्रीम प्रक्रिया विकास और लक्षण वर्णन के लिए उपयोग किया जाता है, यह एक ही जेल पर विभिन्न एचसीपी को अलग कर सकता है।

लाभ: वेस्टर्न ब्लॉटिंग की आवश्यकता नहीं, स्थानांतरण संबंधी समस्याओं से बचा जा सकता है; उत्पाद से HCP अशुद्धियों की ट्रेस मात्रा को अलग किया जा सकता है; सापेक्ष आणविक भार और आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु पर अनुमानित जानकारी प्रदान करता है।

नुकसान: अत्यधिक प्रोटीन एचसीपी स्पॉट को छिपा सकता है; नमूने में एचसीपी का वितरण देखा जा सकता है, लेकिन इसकी मात्रा निर्धारित नहीं की जा सकती।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण:

उद्देश्य: व्यक्तिगत एच.सी.पी. की पहचान करता है, तथा मेजबान कोशिका प्रोटीन के लिए सटीक पहचान और परिमाणीकरण जानकारी प्रदान करता है।

लाभ: उच्च रिज़ॉल्यूशन और सटीकता; व्यक्तिगत एचसीपी की पहचान और निगरानी; एचसीपी का व्यापक स्पेक्ट्रा प्रदान करता है; प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला को कवर कर सकता है; एचसीपी प्रजातियों की पहचान कर सकता है।

नुकसान: उच्च उपकरण और तकनीकी आवश्यकताएं; जटिल संचालन; उच्च लागत; निम्न विधि थ्रूपुट; जटिल नमूना पूर्व उपचार; संभावित मैट्रिक्स प्रभाव; विशेष डेटा विश्लेषण क्षमताओं की आवश्यकता है।

एलिसा विभिन्न देशों में फार्माकोपिया द्वारा जैविक उत्पादों में अवशिष्ट एचसीपी का पता लगाने के लिए अनुशंसित विधि है, जो एचसीपी की कुल मात्रा निर्धारित करने में सक्षम है। हालांकि, एचसीपी के प्रकार और प्रचुरता की पहचान करने में इसकी सीमाएँ हैं और इसे अन्य विधियों के साथ पूरक करने की आवश्यकता है। प्रत्येक पता लगाने की विधि के अपने फायदे और नुकसान हैं, और व्यावहारिक अनुप्रयोगों में, प्रयोगात्मक उद्देश्यों, नमूना विशेषताओं, सटीकता और परिचालन सुविधा के आधार पर चयन किया जा सकता है, अन्य कारकों के साथ, अधिक व्यापक और सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए विभिन्न तरीकों के उपयोग के साथ।

इसके अलावा, यूनाइटेड स्टेट्स फार्माकोपिया यूएसपी <1132> और यूरोपीय फार्माकोपिया ईपी 2.6.34. होस्ट-सेल प्रोटीन परख संकेत देते हैं कि उत्पाद विकास के विभिन्न चरणों में एचसीपी का पता लगाने के लिए विभिन्न एलिसा अभिकर्मकों का उपयोग किया जाना चाहिए, एचसीपी का पता लगाने के तरीकों को वाणिज्यिक अभिकर्मकों, उत्पाद/प्रक्रिया-विशिष्ट विधियों और प्लेटफ़ॉर्म विधियों में वर्गीकृत किया जाना चाहिए।

यूएसपी <1132> में उल्लेख किया गया है कि प्लेटफॉर्म विधियों की अनुपस्थिति में, वाणिज्यिक अभिकर्मकों का उपयोग प्रीक्लिनिकल, चरण I और चरण II नैदानिक ​​परीक्षणों में किया जा सकता है; चरण III नैदानिक ​​परीक्षणों / प्रक्रिया सत्यापन और विपणन के बाद के उत्पाद में, वाणिज्यिक सामान्य एचसीपी पहचान अभिकर्मकों की अपर्याप्त एंटीबॉडी कवरेज जैसी सीमाओं के कारण, सेल प्रकार और प्रक्रिया विशिष्टता जैसे कारकों पर विचार किया जाना चाहिए, अपस्ट्रीम प्रक्रिया विकास के लिए प्लेटफॉर्म विधियों या उत्पाद / प्रक्रिया-विशिष्ट विधियों का उपयोग करना चाहिए।

चित्र 1. यूएसपी <1132> में, उत्पाद विकास के विभिन्न चरणों में एचसीपी का पता लगाने के लिए विशिष्ट तरीकों का उपयोग करने का सुझाव दिया गया है।

तरीका	वाणिज्यिक अभिकर्मक किट	उत्पाद/प्रक्रिया-विशिष्ट पहचान किट	प्लेटफ़ॉर्म डिटेक्शन किट
उपलब्धता	आसानी से उपलब्ध	मेजबान कोशिका रेखाओं की क्लोनिंग सहित एंटीजन की तैयारी की आवश्यकता होती है	नग्न या खाली वेक्टर सेल लाइनों का उपयोग करके एंटीजन की तैयारी की आवश्यकता होती है
विकास	न्यूनतम तैयारी की आवश्यकता है	एंटीजन लक्षण-निर्धारण, टीकाकरण और पुष्टि सहित पता लगाने के विकास में आम तौर पर कम से कम 6 महीने लगते हैं	एंटीजन लक्षण-निर्धारण, टीकाकरण और पुष्टि सहित पता लगाने के विकास में आमतौर पर कम से कम 9 महीने लगते हैं
विविधता	सबसे आम अभिव्यक्ति प्रणालियों तक सीमित	विभिन्न प्रकार की अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग किया जा सकता है	विभिन्न प्रकार की अभिव्यक्ति प्रणालियों का उपयोग किया जा सकता है
विशेषता	विशिष्टता खराब हो सकती है, संभावित रूप से अज्ञात एच.सी.पी.	विशिष्टता आमतौर पर बढ़ाई जाती है, एंटीबॉडी कवरेज विशिष्ट एचसीपी पैटर्न को लक्षित करता है	वाणिज्यिक पहचान विधियों की तुलना में, विशिष्टता में सुधार हुआ है, पहचान प्रदर्शन की समझ बढ़ी है, और एचसीपी प्रकारों का कवरेज भी बढ़ा है
लागत	प्रारंभिक कीमतें अपेक्षाकृत सस्ती हैं, लेकिन संपूर्ण डाउनस्ट्रीम शुद्धिकरण प्रक्रिया के लिए विकास लागत जल्दी ही बढ़ जाएगी	आरंभिक लागत अधिक होती है, लेकिन समतुल्यता बिंदु आमतौर पर अभिकर्मक किटों के 100 सेटों के मूल्य पर होता है	एकाधिक उत्पादों पर इसके लागू होने के कारण, इसमें महत्वपूर्ण लागत लाभ हैं
निर्भरता	किसी विशिष्ट आपूर्तिकर्ता पर निर्भर करते हुए, अभिकर्मक और नियंत्रण योजनाएं "ब्लैक बॉक्स" अवस्था में होती हैं।	सभी अभिकर्मकों और बफ़र्स पर व्यापक नियंत्रण है, किसी भी समय समायोजित किया जा सकता है	सभी अभिकर्मकों पर पूर्ण स्वामित्व और नियंत्रण होता है, जिससे आपूर्ति श्रृंखला और बैच तुलनीयता में जोखिम कम हो जाता है
विनियामक आवश्यकताएँ	विपणन का समर्थन करने के लिए उपयुक्त नहीं है प्राधिकरण आवेदन	प्रारंभिक विकास से लेकर लाइसेंस प्राप्त उत्पादों के विपणन तक की पूरी प्रक्रिया का समर्थन करने के लिए लागू	विपणन प्राधिकरण तक प्रारंभिक विकास का समर्थन करने के लिए लागू

तालिका नंबर एक।विभिन्न एचसीपी अभिकर्मक किट प्रकारों की तुलना

येसेन बायोटेक अनुकूलित एचसीपी परख विकास सेवा

एचसीपी का पता लगाने के महत्व को देखते हुए, येसेन बायोटेक प्रोटीन एंटीबॉडी महत्वपूर्ण कच्चे माल विकास मंच और प्रतिरक्षा पहचान उत्पाद विकास के लिए एक स्वतंत्र प्रयोगशाला स्थापित करने के लिए एक उच्च प्रदर्शन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विकास मंच पर निर्भर करता है, जो एंजाइम इम्यूनोएसे विश्लेषक और 2D-WB द्विदिशात्मक जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस-इम्यूनोब्लॉटिंग सिस्टम जैसे उन्नत अनुसंधान उपकरणों से सुसज्जित है। विकास मंच अत्यधिक परिपक्व है और स्तनधारी कोशिकाओं, कीट कोशिकाओं (जैसे Sf9), बैक्टीरिया और खमीर सहित विभिन्न मेजबान कोशिका अवशेषों के लिए HCP परख किट को तेजी से अनुकूलित करने में सक्षम है।

अनुकूलन समयरेखा

मेजबान कोशिका अवशेष प्रोटीन पहचान किट के लिए अनुकूलन सेवा में आमतौर पर 6 से 10 महीने लगते हैं।

एंटीजन-एंटीबॉडी तैयारी: एचसीपी एंटीजन का निर्धारण, एचसीपी संदर्भ मानकों की स्थापना, प्रतिरक्षा पथ और रणनीति तैयार करना, एचसीपी एंटीबॉडी तैयार करना आदि में आमतौर पर 4 से 6 महीने लगते हैं।

परख किट विकास: एंटीबॉडी अनुकूलन, कवरेज विश्लेषण, परख किट विधि सत्यापन आदि में आमतौर पर 2 से 4 महीने लगते हैं।

येसेन बायोटेक एचसीपी एंटीबॉडी कवरेज सत्यापन सेवा

यह ज्ञात है कि उद्योग में अवशिष्ट एचसीपी का पता लगाने के लिए एलिसा स्वर्ण मानक है, लेकिन इस विधि की सटीकता एचसीपी के लिए बहु-क्लोन एंटीबॉडी के कवरेज पर निर्भर करती है। यूनाइटेड स्टेट्स फार्माकोपिया और यूरोपियन फार्माकोपिया एचसीपी एलिसा एंटीबॉडी और उनके कवरेज को चिह्नित करने के लिए अनुशंसित विधियों के रूप में इम्यूनोप्यूरिफिकेशन और 2डी-डब्लूबी का उल्लेख करते हैं।

एचसीपी एंटीबॉडी कवरेज सत्यापन सेवा

2D-WB सबसे पहले द्वि-आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके आकार और आवेश के आधार पर प्रोटीन को अलग करता है, फिर प्रोटीन छाप का पता लगाने के लिए HCP एंटीबॉडी के साथ इन प्रोटीनों को ऊष्मायन के लिए एक झिल्ली में स्थानांतरित करता है।

हम मेजबान कोशिकाओं जैसे कि CHO, E.coli, HEK293, आदि से HCP नमूनों के लिए एंटीबॉडी कवरेज सत्यापन सेवाएं प्रदान करने के लिए 2D-WB इंस्ट्रूमेंटेशन और व्यापक प्रयोगशाला अनुभव का एक पूरा सेट है।

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ई.कोली एचसीपी एलिसा किट	36712ईएस	48टी/96टी
HEK293 एचसीपी एलिसा किट	36713ईएस	48टी/96टी
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