उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण में, पारंपरिक लाइब्रेरी निर्माण के लिए पीसीआर प्रवर्धन की आवश्यकता होती है। एक ओर, यह ट्रेस डीएनए नमूनों को प्रवर्धित करता है और लाइब्रेरी की उपज को बढ़ाता है। दूसरी ओर, यह फ्लोरोसेंट संकेतों को प्रवर्धित कर सकता है, जिससे अनुक्रमणकर्ताओं के लिए अनुक्रमण सटीकता में सुधार करने के लिए फ्लोरोसेंट संकेतों को पकड़ना और पहचानना आसान हो जाता है। हालाँकि, पीसीआर एक "दोधारी तलवार" की तरह है। कम प्रारंभिक नमूना मात्रा की समस्या को हल करने और फ्लोरोसेंट सिग्नल को बढ़ाने के दौरान, यह प्रवर्धन त्रुटियों और पूर्वाग्रहों को भी पेश करता है, और जीनोम अनुक्रम "ट्रू फेस" को पूरी तरह से प्रस्तुत नहीं कर सकता है। इसके अलावा, पीसीआर पोलीमरेज़ में एक निश्चित प्रवर्धन पूर्वाग्रह होता है। कुछ क्षेत्रों, विशेष रूप से उच्च जीसी या कम जीसी, माध्यमिक संरचना और अन्य क्षेत्रों में, कम प्रवर्धन दक्षता होती है और उन्हें कवर करना मुश्किल होता है। यह बड़ी संख्या में गलत इनडेल्स भी पेश करेगा और बड़ी संख्या में दोहराव लाएगा। , डीएनए डेटा वॉल्यूम की बर्बादी और अनुक्रमण की लागत में वृद्धि। इसलिए, पीसीआर-फ्री तकनीक की शुरूआत से न केवल पीसीआर के फायदे हैं, बल्कि पीसीआर की कमियों को भी दूर किया जा सकता है। यह न केवल उच्च संवेदनशीलता के साथ उच्च गुणवत्ता वाली लाइब्रेरी ला सकता है, और ट्रेस नमूनों का पता लगा सकता है, बल्कि उच्च सटीकता भी रख सकता है और वेरिएंट अध्ययनों के लिए अनुवर्ती सत्यापन कार्यभार को कम कर सकता है। तो पीसीआर-फ्री लाइब्रेरी वास्तव में क्या है और इसके क्या फायदे हैं?

1. पीसीआर-फ्री लाइब्रेरी क्या है?
2. पीसीआर-फ्री तकनीक के क्या लाभ हैं?
3. पीसीआर-फ्री का डेटा प्रदर्शन
4. अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न
5. उत्पाद जानकारी
6. पढ़ने के संबंध में

1. पीसीआर-फ्री लाइब्रेरी क्या है?

अगली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीक आधुनिक आणविक जीव विज्ञान में उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण अनुसंधान में सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है। पारंपरिक पहली पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीक अब शोधकर्ताओं की ज़रूरतों को पूरी तरह से पूरा नहीं कर सकती है। मॉडल जीवों के जीनोम पुनः अनुक्रमण और गैर-मॉडल जीवों के जीनोम अनुक्रमण के लिए अधिक लागत की आवश्यकता होती है। कम, उच्च थ्रूपुट, तेज़ अनुक्रमण तकनीक, इस प्रकार दूसरी पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीक को जन्म देती है। दूसरी पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीक का मुख्य सिद्धांत संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण है, अर्थात, नए संश्लेषित अंत-लेबल आधार जानकारी को कैप्चर करके डीएनए अनुक्रम निर्धारित करना। डीएनए अनुक्रमण के लिए दूसरी पीढ़ी की अनुक्रमण तकनीक का मुख्य सिद्धांत पहले डीएनए को खंडित करना, खंडित डीएनए के अंत की मरम्मत करना और फिर दोनों तरफ़ विशिष्ट एडेप्टर जोड़ना और फिर लाखों स्थानिक रूप से निश्चित पीसीआर उत्पन्न करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग करना है। क्लोनल सरणियों के लिए, प्रत्येक विस्तार प्रतिक्रिया द्वारा सम्मिलित फ्लोरोसेंट लेबल की छवि बनाने के लिए प्राइमर संकरण और एंजाइमेटिक विस्तार प्रतिक्रियाओं का उपयोग करके अनुक्रमण डेटा प्राप्त किया जाता है।

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा डीएनए अनुक्रमण में मुख्य रूप से दो प्रक्रियाएँ शामिल हैं: लाइब्रेरी तैयार करना और मशीन पर अनुक्रमण। लाइब्रेरी तैयार करने के दौरान, बेतरतीब ढंग से बाधित जीनोमिक टुकड़े आमतौर पर मानक पीसीआर द्वारा प्रवर्धित होते हैं। हालांकि, कुछ विशेष टेम्पलेट्स के लिए, जटिल माध्यमिक संरचना या खराब थर्मल स्थिरता जैसे कारक हैं, जो टेम्पलेट पीसीआर की प्रवर्धन वरीयता को प्रभावित करते हैं, इसलिए सभी जीनोमिक अनुक्रम पीसीआर प्रवर्धन लाइब्रेरी में समान रूप से परिलक्षित नहीं हो सकते हैं। विशेष रूप से उच्च जीसी या उच्च एटी सामग्री वाले कुछ टेम्पलेट्स के लिए, कभी-कभी लाइब्रेरी निर्माण के लिए प्रवर्धन करने के लिए पीसीआर विधि का उपयोग करना मुश्किल होता है। मशीन पर अनुक्रमण करते समय पीसीआर-मुक्त लाइब्रेरी और पारंपरिक पीसीआर लाइब्रेरी के बीच कोई अंतर नहीं हैपीसीआर-मुक्त लाइब्रेरी लाइब्रेरी निर्माण विधि का पूरक है। चूंकि इसे पीसीआर प्रवर्धन के बिना सीधे ऑनबोर्ड लाइब्रेरी में तैयार किया जाता है, इसलिए यह कुछ उच्च जीसी या उच्च एटी क्षेत्रों के कवरेज में सुधार कर सकता है, जिससे पीसीआर, डेटा पूर्वाग्रह और अनुक्रम पुनरावृत्ति द्वारा पेश किए गए त्रुटि आधारों को कम किया जा सकता है।

पारंपरिक एनजीएस लाइब्रेरी निर्माण के मुख्य चरण जीनोम विखंडन, अंत मरम्मत, एडाप्टर जोड़, पीसीआर और अनुक्रमण से पहले संकेत प्रवर्धन हैं। तो, पीसीआर-मुक्त लाइब्रेरी निर्माण के बारे में क्या? जैसा कि नाम से पता चलता है, यह एक लाइब्रेरी-निर्माण प्रक्रिया है जिसमें पीसीआर की आवश्यकता नहीं होती है। लाइब्रेरी निर्माण के मुख्य चरण जीनोम विखंडन, अंत संशोधन, लिंकर जोड़ और लाइब्रेरी गुणवत्ता नियंत्रण हैं। लेकिन वास्तव में, इसे केवल लाइब्रेरी निर्माण प्रक्रिया में पीसीआर-मुक्त माना जा सकता है। वास्तविक पीसीआर-मुक्त लाइब्रेरी निर्माण से लेकर लाइब्रेरी प्रवर्धन के बिना अनुक्रमण तक की प्रक्रिया होनी चाहिए (जैसे एकल-अणु अनुक्रमण तकनीक) या पीसीआर प्रवर्धन त्रुटियों के संचय के बिना अनुक्रमण तकनीक (जैसे एमजीआई का डीएनबीएसईक्यू)।

चित्र 1. पारंपरिक पुस्तकालय निर्माण और पीसीआर-मुक्त पुस्तकालय निर्माण का प्रवाह चार्ट

2. पीसीआर-फ्री तकनीक के क्या लाभ हैं?

नियमित लाइब्रेरी निर्माण प्रक्रिया में, प्रवर्धन एंजाइम त्रुटियाँ पेश कर सकता है। चक्रीय प्रवर्धन के माध्यम से, ये त्रुटियाँ संचित और प्रवर्धित होंगी, जिससे DNA अनुक्रम प्रतिकृति की निष्ठा कम होगी। इसके अलावा, DNA पोलीमरेज़ में एक निश्चित प्रवर्धन पूर्वाग्रह भी होता है, विशेष रूप से GC सामग्री या द्वितीयक संरचनाओं में बड़े अंतर वाले क्षेत्रों के लिए, जिसके परिणामस्वरूप कम प्रवर्धन दक्षता और खराब कवरेज एकरूपता होती है; गलत InDels को पेश करते समय, यह बड़ी संख्या में दोहराव भी लाएगा जिससे DNA डेटा की मात्रा बर्बाद होती है और अनुक्रमण लागत बढ़ जाती है। PCR-मुक्त तकनीक पारंपरिक लाइब्रेरी निर्माण में PCR प्रवर्धन द्वारा पेश की गई उपर्युक्त समस्याओं से अच्छी तरह बच सकती है। लाइब्रेरी निर्माण और अनुक्रमण की प्रक्रिया में इसलिए, पीसीआर प्रवर्धन प्रक्रिया में, यह गारंटी नहीं दी जा सकती है कि सभी जीनोमिक टुकड़े समान प्रवर्धन दक्षता प्राप्त कर सकते हैं, लेकिन एक स्पष्ट प्रवर्धन पूर्वाग्रह है, जैसे कि जीनोम के उच्च जीसी या कम जीसी क्षेत्रों में कम कवरेज। हालांकि, पीसीआर-फ्री सीक्वेंसिंग की पूरी प्रक्रिया में कोई पीसीआर नहीं है। पीसीआर लाइब्रेरी निर्माण की तुलना में, जीनोम के उच्च जीसी क्षेत्रों और एटी / टीए दोहराव वाले क्षेत्रों की कवरेज में सुधार हुआ है। विशिष्ट लाभ इस प्रकार हैं।

2.1 सुव्यवस्थित पुस्तकालय तैयारी प्रक्रिया, समय की बचत

पीसीआर-मुक्त लाइब्रेरी तैयारी पीसीआर प्रवर्धन और अन्य चरणों की आवश्यकता को समाप्त करती है, जिससे लाइब्रेरी तैयारी प्रक्रिया सरल हो जाती है और समय की बचत होती है।

2.2 लाइब्रेरी तैयार करने की लागत में कमी

पारंपरिक लाइब्रेरी तैयार करने की प्रक्रिया में, अनुक्रम प्रामाणिकता सुनिश्चित करने के लिए पीसीआर प्रवर्धन के लिए महंगे उच्च-निष्ठा एंजाइम का उपयोग किया जाता है। साथ ही, पीसीआर-फ्री पीसीआर प्रवर्धन चरण को समाप्त करता है, जिससे लाइब्रेरी तैयार करने की लागत कम हो जाती है।

2.3 प्रवर्धन पूर्वाग्रह को कम करें

डीएनए प्रवर्धन एंजाइमों में कुछ प्रवर्धन पूर्वाग्रह होते हैं, विशेष रूप से जीसी सामग्री या द्वितीयक संरचना में महत्वपूर्ण अंतर वाले टेम्पलेट्स के लिए। इसलिए, पीसीआर-फ्री पॉलीमरेज़ के कारण होने वाले प्रवर्धन पूर्वाग्रह से प्रभावी रूप से बच सकता है।

2.4 कोई पीसीआर दोहराव नहीं

पीसीआर-फ्री डुप्लिकेट रीड्स को कम कर सकता है और यूनिक मैपिंग दरों और प्रभावी डेटा उपयोग को बढ़ा सकता है।

2.5 कम त्रुटि पारे

पीसीआर प्रवर्धन से सम्मिलन और विलोपन की प्रतिकृति त्रुटियां उत्पन्न होने की अधिक संभावना होती है, जिसके परिणामस्वरूप इण्डेल अनुक्रमण की त्रुटि दर अधिक होती है, जबकि पीसीआर-फ्री ऐसी त्रुटियों की उत्पत्ति और संचयन को प्रभावी रूप से टाल सकता है।

3. पीसीआर-फ्री का डेटा प्रदर्शन

Hieff NGS™ अल्टिमा प्रो पीसीआर फ्री डीएनए लाइब्रेरी प्रेप किट V2 (कैट# 12196ES) की लाइब्रेरी रूपांतरण दर प्रतिस्पर्धी उत्पादों की तुलना में बेहतर है।

चित्र 2. पीसीआर-फ्री लाइब्रेरी निर्माण के लिए ऑफ-मशीन अनुक्रमण डेटा की मात्रा

4. अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न

प्रश्न: पीसीआर-मुक्त लाइब्रेरी के लिए किस प्रकार के नमूने उपयुक्त हैं?

उत्तर: जटिल द्वितीयक संरचना, उच्च GC और PCR वरीयता वाले कुछ नमूने निर्माण के लिए PCR-मुक्त लाइब्रेरी चुन सकते हैं।

प्रश्न: पीसीआर-मुक्त लाइब्रेरी का सामान्य खंड आकार क्या है?

उत्तर: पीसीआर-मुक्त लाइब्रेरी में फ़्रैगमेंट आकार पर कोई विशेष आवश्यकता नहीं होती है। पीसीआर उत्पाद लाइब्रेरी, लाइब्रेरी का निर्माण पीसीआर उत्पाद के आकार के अनुसार किया जाता है। जीनोमिक लाइब्रेरी के लिए, इसे लगभग 350bp होने की अनुशंसा की जाती है, ताकि लाइब्रेरी डेटा की गुणवत्ता अपेक्षाकृत अच्छी हो।

5. उत्पाद जानकारी

येसेन जो उत्पाद उपलब्ध करा सकता है, वह तालिका 1 में दर्शाया गया है।

तालिका 1. उत्पाद जानकारी

6. पढ़ने के संबंध में

डीएनए नमूनों से एनजीएस लाइब्रेरी तैयार करने का समाधान

एनजीएस-संबंधित प्रौद्योगिकी के बारे में आप कितना जानते हैं?