स्टेम सेल थेरेपी और ऑर्गेनोइड-आधारित दवा विकास की उन्नति के साथ, बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स स्टेम सेल कल्चर और ऑर्गेनोइड, 3D सेल कल्चर और एंजियोजेनेसिस, इन विवो ट्यूमरोजेनेसिस प्रयोगों आदि सहित अन्य अनुप्रयोगों के लिए पोषक तत्व और सहायक वाहक के रूप में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सेट्योरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन एक्सट्रैक्ट्स को एंजेलब्रेथ-होल्म-स्वार्म (ईएचएस) माउस ट्यूमर से निकाला जाता है जो लैमिनिन, टाइप IV कोलेजन, नेस्टिन आदि IGF, FGF और अन्य वृद्धि कारकों सहित एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन से भरपूर होते हैं। कमरे के तापमान पर, सेट्योरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स एक जैविक रूप से सक्रिय तीन आयामी मैट्रिक्स बनाने के लिए पॉलीमराइज़ हो जाता है। यह विवो में सेल बेसमेंट मेम्ब्रेन की संरचना, संरचना, भौतिक गुणों और कार्यों का अनुकरण कर सकता है, जो इन विट्रो में कोशिकाओं की संस्कृति और भेदभाव के लिए फायदेमंद है और एक अच्छा मैट्रिजेल विकल्प है।

1. सेट्योरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स क्या है?
2. सेटुरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स की क्या भूमिका है?
3. सेटुरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स की विशेषताएं क्या हैं?
4. सेटुरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स का लोकप्रिय अनुप्रयोग
5. अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न
6. येसेन से सेटुरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स का चयन गाइड

1. सेट्योरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स क्या है?

एंडोथेलियल कोशिकाओं, उपकला कोशिकाओं, मांसपेशियों और न्यूरोनल कोशिकाओं से सटे मैट्रिक्स एक सतत, स्तरित बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स बनाते हैं जिसे बेसमेंट झिल्ली कहा जाता है। बेसमेंट झिल्ली विकास और घाव भरने के दौरान क्षीण और पुनर्जीवित होती है। यह न केवल कोशिकाओं और कोशिका परतों का समर्थन करता है, बल्कि कोशिका आसंजन, प्रवास, प्रसार और विभेदन को प्रभावित करके ऊतकों के निर्माण में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो बेसमेंट झिल्ली के कार्य हैं। इसलिए, यह कहा जा सकता है कि बेसमेंट झिल्ली मेटास्टेटिक ट्यूमर कोशिकाओं के आक्रमण के लिए मुख्य बाधा है।

चित्र 1. सेट्योरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स

YEASEN द्वारा विकसित और उत्पादित सेट्यूरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स में LDEV (लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज एन्हांसिंग वायरस) नहीं होता है और इसमें बहुत कम एंडोटॉक्सिन सामग्री होती है। और माइकोप्लाज्मा का पता लगाने के बाद यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई माइकोप्लाज्मा संदूषण नहीं है, जिसमें विभिन्न प्रकार जैसे कि मूल सांद्रता, उच्च सांद्रता और कम वृद्धि कारक शामिल हैं।

2. सेटुरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स की क्या भूमिका है?

सेचरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स का उपयोग विभिन्न आवश्यकताओं के बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स तैयार करने के लिए किया जा सकता है। इसका उपयोग सेल सिग्नलिंग अध्ययनों के लिए किया जा सकता है, जैसे कि माउस किडनी स्टेम सेल द्वारा रीनल ट्यूब्यूल के निर्माण में वृद्धि कारकों की भूमिका का अध्ययन, माउस मैमरी एपिथेलियल स्टेम सेल का जीन अभिव्यक्ति अध्ययन और ट्रांसवेल का ट्यूमर इनवेसिवनेस प्रयोग। साथ ही, इसका उपयोग सेल आकृति विज्ञान, जैव रासायनिक कार्य, प्रवास, संक्रमण और जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए किया जा सकता है। सेचरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स उपकला कोशिकाओं और अन्य प्रकार की कोशिकाओं के जुड़ाव और भेदभाव में प्रभावी रूप से मदद कर सकता है, जिसमें तंत्रिका कोशिकाएं, स्टेम सेल, स्तनधारी उपकला कोशिकाएं, मेलेनोमा कोशिकाएं, संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाएं, थायरॉयड कोशिकाएं और बाल कूप कोशिकाएं शामिल हैं। साथ ही, सेचरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स म्यूरिन मैमरी एपिथेलियल कोशिकाओं के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर को भी प्रभावित करता है और परिधीय तंत्रिका पुनर्जनन का समर्थन करता है।

चित्र 2.Ceturegel™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स की मुख्य अनुप्रयोग दिशाएँ

सेल माइग्रेशन और आक्रमण विस्तार से: सेल माइग्रेशन, जिसे सेल क्रॉलिंग, मूवमेंट या मूवमेंट के रूप में भी जाना जाता है, माइग्रेशन सिग्नल प्राप्त करने या कुछ पदार्थों के ढाल को महसूस करने के बाद कोशिकाओं की गति को संदर्भित करता है। सेल माइग्रेशन सेल हेड में स्यूडोपोडिया के विस्तार, नए आसंजनों की स्थापना और सेल बॉडी की पूंछ के पीछे हटने की एक वैकल्पिक प्रक्रिया है। सेल माइग्रेशन सामान्य कोशिकाओं के मूल कार्यों में से एक है, और यह शरीर की सामान्य वृद्धि और विकास की एक शारीरिक प्रक्रिया भी है। जीवित कोशिकाओं की गति के एक सर्वव्यापी रूप के रूप में, यह कई तरह की सामूहिक शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में भाग ले सकता है। जैसे कि भ्रूण विकास, एंजियोजेनेसिस, घाव भरना, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, भड़काऊ प्रतिक्रिया, एथेरोस्क्लेरोसिस, कैंसर मेटास्टेसिस, आदि। जबकि, सेल आक्रमण कोशिकाओं की बाह्य कोशिकीय मैट्रिक्स के माध्यम से एक क्षेत्र से दूसरे क्षेत्र में माइग्रेट करने की क्षमता को संदर्भित करता है। सेल आक्रमण सामान्य कोशिकाओं और कैंसर कोशिकाओं की रासायनिक और यांत्रिक उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया है। सेल आक्रमण अक्सर घाव भरने, एंजियोजेनेसिस, सूजन, ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस और ऊतकों की असामान्य घुसपैठ की प्रक्रियाओं में होता है।

3. सेटुरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स की विशेषताएं क्या हैं?

उच्च सुरक्षा: कोई एलडीईवी (लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज बढ़ा हुआ वायरस) नहीं
सांद्रता विविधता: सांद्रता सीमा 8 ~ 20 मिलीग्राम / एमएल के बीच है
अच्छा बैच स्थिरताबैचों के बीच स्थिर प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए सख्त उत्पादन गुणवत्ता निरीक्षण प्रक्रिया
कम एंडोटॉक्सिन: एंडोटॉक्सिन सामग्री <8 ईयू/एमएल
संदूषण का पता लगाना: कोई माइकोप्लाज्मा, बैक्टीरिया और कवक अवशेष नहीं पाए गए हैं
उच्च एकल बैच आउटपुट: एकल बैच आउटपुट 50L स्तर से ऊपर है
अनुकूलता: किसी भी प्रकार के सेल कल्चर माध्यम के साथ संगत

4. सेटुरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स का लोकप्रिय अनुप्रयोग

4.1 प्रवास और आक्रमण परख

कोशिका प्रवास और आक्रमण की क्षमता का पता लगाने की प्रायोगिक विधि ट्रांसवेल प्रयोग है, और ट्रांसवेल को छिद्रण प्रयोग भी कहा जाता है। कक्ष में घने छिद्र होने के कारण पहले कक्ष में कोशिका निलंबन जोड़ा जाता है। फिर कक्षों को 24-कुओं वाली प्लेट में रखा गया, जिसमें एक पूर्ण माध्यम जोड़ा गया। कोशिकाएँ विकृत हो गईं और कक्ष में छिद्रों से होकर अधिक पोषक तत्वों से भरपूर कक्ष के बाहर चली गईं, जहाँ वे बाहर की ओर चिपक गईं। कक्ष के बाहर कोशिकाओं को रंगने और गिनने से कोशिकाओं के प्रवास और आक्रमण की क्षमता का अंदाजा लगाया जा सकता है। ट्रांसवेल का सिद्धांत छोटे कक्ष को कल्चर प्लेट में रखना है, छोटे कक्ष को ऊपरी कक्ष कहा जाता है, और कल्चर प्लेट को निचला कक्ष कहा जाता है। कल्चर द्रव की ऊपरी और निचली परतों को एक पॉलीकार्बोनेट झिल्ली द्वारा अलग किया जाता है, कल्चर द्रव की ऊपरी परत को ऊपरी कक्ष में जोड़ा जाता है, और कल्चर द्रव की निचली परत को निचले कक्ष में जोड़ा जाता है। कोशिकाएँ ऊपरी कक्ष में होती हैं, और निचले माध्यम की संरचना झिल्ली की पारगम्यता के कारण ऊपरी कक्ष में कोशिकाओं को प्रभावित करेगी। इसके अलावा, कोशिका वृद्धि और गति पर निचले माध्यम में मौजूद घटकों के प्रभावों की जांच की गई।
माइग्रेशन और आक्रमण परख में सेटरेजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स के विशिष्ट संचालन: पतला सेटरेजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स को ट्रांसवेल के ऊपरी कक्ष में जोड़ा गया, और कोशिकाओं को 37°C, 5% CO में प्लेटेड और इनक्यूबेट किया गया₂ 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में रखा गया, 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में स्थिर किया गया, और 0.1% क्रिस्टल वायलेट स्टेनिंग घोल से रंगा गया। कोशिकाओं को एक उल्टे चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत देखा और गिना गया।

चित्र 3. कोशिका आक्रमण के बाद क्रिस्टल वायलेट अभिरंजन के परिणाम

4.2 एंजियोजेनेसिस

1) प्रयोग से एक दिन पहले, Ceturegel™ निकाल लें मैट्रिजेल को फ्रीजर से निकालें और इसे 4°C वाले रेफ्रिजरेटर में रात भर के लिए रख दें, ताकि यह पिघल जाए, जबकि उपयोग की गई उपभोग्य सामग्रियों को पहले से ठंडा कर लें।
2) प्रयोग से पहले हमेशा सेट्योरजेल™ मैट्रिजेल को आइस बॉक्स में रखें। एंजियोजेनिक स्लाइड की स्टेराइल पैकेजिंग खोलें और स्लाइड को बाहर निकालें।
3) प्रत्येक वेल में 10 μl सेचरजेल™ मैट्रिजेल डालें। ध्यान दें कि सेचरजेल™ मैट्रिजेल डालते समय पिपेट की नोक आंतरिक छेद के शीर्ष पर लंबवत होनी चाहिए ताकि मैट्रिजेल ऊपरी छेद से बहकर गोंद का अवशेष न छोड़ दे।
4) सबसे पहले स्लाइड को ढकें, 10 सेमी का पेट्री डिश तैयार करें, और गीले बॉक्स बनाने के लिए पानी में भिगोए हुए कागज के तौलिये रखें।
5) स्लाइड्स को पेट्री डिश में डालें और पेट्री डिश को ढक दें। इसे CO में रखें₂ इनक्यूबेटर में इसे लगभग 30 मिनट तक रखें, जेल के जमने तक प्रतीक्षा करें, और उसी समय सेल सस्पेंशन तैयार करें।
6) पचे हुए कोशिकाओं को 2*10 घनत्व वाले सेल सस्पेंशन में तैयार करें⁵ कोशिकाओं/एमएल और अच्छी तरह से मिश्रण।
7) रक्त वाहिका वाली कांच की स्लाइड को निकालें जो जेल में जम गई है। प्रत्येक वेल में 50 μl सेल सस्पेंशन डालें, ध्यान रखें कि पिपेट टिप ऊपरी वेल के ऊपर लंबवत रहे और निचले वेल में जेल को न छुए।
8) सेल कल्चर मीडियम डालें, ढक्कन बंद करें और इसे ऐसे ही रहने दें। कुछ समय बाद, सभी कोशिकाएँ मैट्रिजेल की सतह पर डूब जाएँगी।

चित्र 4. एंजियोजेनेसिस परिणाम ग्राफ

इम्यूनोफ्लोरेसेंस अभिरंजन

1) गोंद या सेल नेटवर्क को छुए बिना कुओं से माध्यम को सावधानीपूर्वक हटाएँ। सीरम-मुक्त माध्यम में कैल्सीन को 6-8 µg/ml की अंतिम सांद्रता तक पतला करें। कोशिकाओं को पूरी तरह से डुबाने के लिए सेल स्टेनिंग घोल डालें और कमरे के तापमान पर 30-40 मिनट के लिए अंधेरे में रखें।
2) पीबीएस से तीन बार धोएं। ध्यान रखें कि कोशिकाओं पर प्रभाव से बचने के लिए पीबीएस को धीरे-धीरे ऊपरी कुओं में डाला जाना चाहिए। Ex=485 nm, Em=529 nm तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके प्रतिदीप्ति अवलोकन

चित्र 5. रक्त वाहिकाओं का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधलापन

4.3 3डी कोशिका संवर्धन

पारंपरिक सेल कल्चर के विपरीत, 3D सेल कल्चर कोशिकाओं के इन विवो वातावरण को पुन: पेश करता है। यहां तक ​​कि सरल गोलाकार मॉडल भी मोनोलेयर कल्चर की कमियों की भरपाई कर सकते हैं। ये संरचनाएं ऑक्सीजन, पोषक तत्वों, मेटाबोलाइट्स और घुलनशील संकेतों के ग्रेडिएंट बना सकती हैं, जो बदले में विविध सेल आबादी बनाती हैं। 3D सेल कल्चर तकनीक प्राकृतिक वातावरण को बेहतर ढंग से अनुकरण कर सकती है जिसमें कोशिकाएं जीवों में रहती हैं, जिससे कोशिकाओं और जैव रासायनिक और शारीरिक प्रतिक्रियाओं के बीच बातचीत अधिक यथार्थवादी हो जाती है। 3D वातावरण में, अंतर्जात और बहिर्जात उत्तेजनाओं के प्रति कोशिकाओं की प्रतिक्रियाएँ उनकी इन विवो प्रतिक्रियाओं से अधिक निकटता से मिलती जुलती हैं।
3D कोशिका संवर्धन में सेटरेजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स का विशिष्ट संचालन इस प्रकार है: सेटरेजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स को एकल-कोशिका हेपजी2 सस्पेंशन 1:1 की समायोजित सांद्रता के साथ धीरे से मिलाएं, और पूर्व-शीतित 24-वेल प्लेट में पूर्व-शीतित पिपेट टिप के साथ उपरोक्त मिश्रित एकल-कोशिका सस्पेंशन के 50 μl को मिलाएं जिससे आर्क के आकार की कोशिका बूंदें बन जाएं जिन्हें 37°C, 5% CO2 इनक्यूबेटर में संवर्धित किया गया, प्रतिदिन उनका निरीक्षण और फोटोग्राफ लिया गया।

चित्र 6. 3D सेल कल्चर परिणाम

तालिका 1. 3D सेल कल्चर सीटुरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स उपयोग संदर्भ:

नोट: Ceturegel™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स के विभिन्न बैचों में एक निश्चित सांद्रता अंतर होता है, अनुशंसित खुराक केवल संदर्भ के लिए है

4.4 जीव में ट्यूमर निर्माण प्रयोग

नग्न चूहों में हेपजी2 कोशिकाओं के उपचर्म ट्यूमरजनन प्रयोग को एक उदाहरण के रूप में लेते हुए, 1:1 कमजोर पड़ने के लिए सीटुरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स और सेल सस्पेंशन का उपयोग किया गया, और 4-5 सप्ताह की आयु वाली BALB/c-nu मादा चूहों को उपचर्म रूप से टीका लगाया गया। प्रयोगात्मक प्रक्रिया इस प्रकार है:
♦ हेपजी2 कोशिकाओं को लघुगणकीय वृद्धि और लगभग 80-90% कोशिका घनत्व के साथ तैयार करें, और कोशिकाओं को एकत्रित करने से एक रात पहले ताजा माध्यम बदल दें।
♦ कोशिकाओं को ट्रिप्सिन द्वारा पचाया जाता है। जब कोशिकाएँ गोल हो जाती हैं और कल्चर डिश से बाहर नहीं निकलती हैं, तो ट्रिप्सिन को हटा दिया जाता है, कोशिका निलंबन बनाने के लिए सीरम-मुक्त माध्यम मिलाया जाता है, एक बार सेंट्रीफ्यूज करके साफ किया जाता है, और अंतिम सांद्रता 5 × 10 होती है⁷ कोशिकाएं/एमएल.
♦ 5 × 10 की अंतिम सांद्रता तैयार करने के लिए सेल सस्पेंशन और सेटरेजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स को 1:1 अनुपात में 4 ℃ पर पतला करें⁷ कोशिकाएं/एमएल.
♦ बाएं हाथ से एक स्थिर नग्न चूहे को पकड़ें, और नग्न चूहे के दाहिने कंधे पर चमड़े के नीचे इंजेक्शन लगाएं। टीकाकरण के दौरान, सुई को चमड़े के नीचे थोड़ा गहरा, लगभग 1 सेमी गहरा डाला जाता है, ताकि इंजेक्शन के बाद सुई की आंख से सेल निलंबन के अतिप्रवाह को कम किया जा सके।
टीकाकरण की मात्रा 200 μ L है। (यह प्रक्रिया यथासंभव आधे घंटे के भीतर पूरी होनी चाहिए। रास्ते में, सेल एपोप्टोसिस को धीमा करने और जेल घटना को रोकने के लिए सेल निलंबन को बर्फ पर रखा जाना चाहिए)।
♦ नग्न चूहों को भोजन जारी रखने के लिए पिंजरे में वापस रख दें, और ट्यूमर को लगभग 1 सप्ताह से 1 महीने तक देखा जा सकता है।प्रायोगिक डिजाइन के अनुसार, जब ट्यूमर का आकार आवश्यकताओं को पूरा कर ले तो नग्न चूहों को मार दिया जाता है, और उनकी तस्वीरें ली जाती हैं।

नोट: नियंत्रण समूह संवर्धन माध्यम और कोशिकाओं का निलंबन है, और अंतिम घनत्व मैट्रिक्स गोंद परीक्षण समूह के समान है।

4.5 ऑर्गेनोइड कल्चर

ऑर्गेनॉइड्स 3D बहुकोशिकीय छोटे ऊतक होते हैं जो स्टेम सेल से अलग होते हैं। अंगों के कुछ गुणों को पुन: प्रस्तुत किया जा सकता है। ऑर्गेनॉइड्स बहुकोशिकीय होते हैं और उच्च स्तर की स्व-संयोजन प्रदर्शित करते हैं, और इसलिए पारंपरिक 2D संस्कृतियों की तुलना में जटिल इन विवो सेलुलर प्रतिक्रियाओं और अंतःक्रियाओं को प्रदर्शित करने में बेहतर होते हैं। सामान्य या रोगग्रस्त ऊतक से स्टेम सेल और/या अंग पूर्वज कोशिकाओं को सेटरेगेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स या कोलेजन के साथ मिलाया जा सकता है। गुर्दे, थायरॉयड, यकृत, मस्तिष्क, फेफड़े, आंत, प्रोस्टेट और अन्य सूक्ष्म अंगों का निर्माण करें। उदाहरण के लिए, आनुवंशिक स्क्रीनिंग करने वाले शोधकर्ताओं के लिए, सेटरेगेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स सब्सट्रेट का उपयोग बायोइंक के रूप में किया जा सकता है ताकि 3D बायोप्रिंटिंग में जीवित कोशिकाओं/ऑर्गेनॉइड्स का सटीक स्थानीयकरण और एम्बेडिंग सक्षम हो सके।

चित्र 7. ऑर्गेनोइड ऑपरेशन प्रक्रिया

माउस छोटी आंत के ऑर्गेनोइड निर्माण

नमूना तैयार करना: चूहों की गर्दन काटकर उन्हें मार दिया गया, और सतह को नसबंदी के लिए शराब के साथ छिड़का गया। बाँझ वातावरण के तहत गैस्ट्रिक छोर के पास 3 ~ 15 सेमी आंत के ऊतक को काट लें, चिमटी के साथ आंत के मार्ग के बाहर मेसेंटरी और वसा को सावधानीपूर्वक हटा दें, और इसे 4 ℃ पर प्रीकूल्ड 1% डबल एंटीबॉडी युक्त DPBS समाधान में डालें।

नमूना सफाई: आंत्र पथ को 2-3 बार फ्लश करने के लिए एक सिरिंज का उपयोग करें, आंत्र गुहा को ऊपर की ओर रखते हुए आंत्र पथ को सावधानीपूर्वक काटने के लिए सर्जिकल कैंची का उपयोग करें, और आंत्र गुहा की सतह पर आंत्र विली को धीरे से खुरचने के लिए एक सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करें, और आंत्र विली के खुरचने के बाद (पारदर्शी ऊतक दिखाते हुए), आंत्र ऊतक को डीपीबीएस युक्त एक नए संस्कृति डिश में 2-3 बार रखें।

नमूनों का प्रारंभिक उपचार: धुले हुए छोटे आंत के ऊतकों को 2 मिमी चौड़े छोटे टुकड़ों में काटें, और फिर उन्हें एक नए 50 मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। आंतों के विल्लस कोशिकाओं और तैरते हुए वसा ऊतक को हटाने के लिए उन्हें DPBS से 3-5 बार धीरे से धोएँ।

नमूना पाचन: पाचन के लिए साफ किए गए छोटे आंत्र टुकड़ों में 3-5mM EDTA युक्त 10-15ml प्रीकूल्ड DPBS मिलाएं, लगभग 30 मिनट के लिए 4 ℃ पर इनक्यूबेट करें, और इस अवधि के दौरान हर 10 मिनट में सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को धीरे से हिलाएं।

पाचन के बाद, EDTA पाचन विलयन के सतह पर तैरने वाले तरल को हटा दें और शेष EDTA को हटाने के लिए ऊतकों को नए DPBS बफर विलयन से 2-3 बार धीरे से धो लें।

छोटी आंत के ऊतक के टुकड़ों में 0.1% BSA युक्त 10-15ml प्रीकूल्ड DPBS डालें, ऊतक के टुकड़ों को बार-बार उड़ाएँ और फिर से लटकाएँ ताकि बेसल परत से अवकाश अलग हो जाए, फिर सूक्ष्म परीक्षण के लिए थोड़ा निलंबन लें। जब बड़ी संख्या में अवकाश जैसी संरचनाएँ दिखाई दें, तो उड़ाना बंद करें, और उड़ाए गए ऊतक निलंबन μM फ़िल्टर स्क्रीन के लिए 70% का उपयोग करें ताकि फ़िल्टर स्क्रीन से गुज़रने वाले ऊतक निलंबन को फ़िल्टर और एकत्र किया जा सके।

चरण 5-6 को दो बार दोहराएं और 3 मिनट के लिए 1500rpm और 4 ℃ पर सेंट्रीफ्यूज करें।

मिश्रण का निर्माण: सेटुरजेल™ मैट्रिक्स ग्लू हेवी सस्पेंशन अवकाश ऊतक अवक्षेपण, प्रत्येक 10 μL मैट्रिक्स ग्लू सस्पेंशन में 200~600 अवकाश होते हैं। पुनः निलंबन के बाद, मिश्रण को बर्फ पर रखा जाता है और मैट्रिक्स ग्लू को जेल बनाने से रोकने के लिए जितनी जल्दी हो सके संचालित किया जाता है।
नोट: मैट्रिक्स चिपकने वाली संरचना की स्थिरता के लिए संस्कृति की प्रक्रिया में सेट्योरजेल™ सुनिश्चित करने के लिए मैट्रिक्स गोंद का कमजोर अनुपात ≥ 50% होना चाहिए।

मिश्रित निलंबन को 24-वेल प्लेट के तल के केंद्र में, 30~50μL प्रति वेल बाएं और दाएं, स्थापित करें ताकि निलंबन छिद्र प्लेट की पार्श्व दीवार के संपर्क में न आए।

संवर्धित संस्कृति प्लेट को 37 ℃ कार्बन डाइऑक्साइड निरंतर तापमान इनक्यूबेटर में रखें, और मैट्रिक्स जेल के ठोस होने तक लगभग 30 मिनट तक इसे सेते रहें।

मैट्रिक्स गोंद के पूरी तरह से जम जाने के बाद, तैयार आंत्र अंग संवर्धन माध्यम को धीरे-धीरे दीवार के साथ 800μL प्रति कुण्ड में डालें।

24-वेल प्लेट को कल्चर के लिए 37 ℃ कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में रखें। हर 3 दिन में ताजा माध्यम बदलें और अंग जैसे अंगों की वृद्धि की स्थिति की निगरानी करें। आम तौर पर, चूहों के अंग जैसे छोटी आंत के अंग 5-7 दिनों के भीतर बन जाते हैं।

चित्र 8. चूहे की छोटी आंत जैसे अंगों के इन विट्रो कल्चर के परिणाम

5. अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न

1. प्राप्त सब्सट्रेट के रंग अंतर (हल्के पीले से गहरे लाल) का कारण क्या है?
फिनोल रेड युक्त सीटुरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स के लिए, यह मुख्य रूप से फिनोल रेड और बाइकार्बोनेट की CO के साथ परस्पर क्रिया के कारण होता है₂, लेकिन 5% CO के साथ संतुलन के बाद रंग अंतर कम हो जाएगा₂ठंडा करने और पिघलाने के बाद, सेट्योरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स को समान रूप से फैलाने के लिए शीशी को धीरे से हिलाएं।
2. Ceturegel™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स के संचालन में किन बातों पर ध्यान दिया जाना चाहिए?
सभी ऑपरेशन रोगाणुरहित वातावरण में किए जाने चाहिए, तथा यह सुनिश्चित करने के लिए कि सेटुरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स समरूप है, पूर्व-शीतित पिपेट का उपयोग किया जाना चाहिए।
3. उपयोग के लिए Ceturegel™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स को कैसे फ्रीज और स्टोर करें?
जमे हुए और पिघले हुए सेचरजेल™ मैट्रिक्स LDEV-फ्री सेचरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स को कई छोटी ट्यूबों में वितरित किया जा सकता है। सभी वितरण पहले से ठंडे क्रायोवियल में होने चाहिए, जिन्हें कई बार जमने और पिघलने से बचाने के लिए जल्दी से जमाया और संग्रहीत किया जाना चाहिए। उपयोग से पहले सभी वस्तुओं को पहले से ठंडा किया जाना चाहिए। सेचरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स को संभालने के लिए पहले से ठंडे पिपेट, टिप्स और छोटी ट्यूब का उपयोग करें।

6. येसेन से सेटुरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स का चयन गाइड

विभिन्न प्रकार के सेचरगेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स के अलग-अलग अनुप्रयोग हैं। सेचरगेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स की मानक सांद्रता का उपयोग ध्रुवीय कोशिका संवर्धन, जैसे उपकला कोशिकाओं के लिए किया जा सकता है। यह विभिन्न कोशिकाओं के विभेदन को बढ़ावा दे सकता है और ट्यूमर सेल माइग्रेशन और आक्रमण प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सेचरगेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स की उच्च सांद्रता का व्यापक रूप से विवो में उपयोग किया जाता है और इसका उपयोग ट्यूब्यूल गठन प्रयोगों के लिए किया जा सकता है। कम वृद्धि कारक (GFR) का मुख्य कार्य प्रयोग में वृद्धि कारकों के हस्तक्षेप को खत्म करना है, और यह बेसमेंट मेम्ब्रेन तैयारी के लिए उच्च आवश्यकताओं वाले अध्ययनों के लिए उपयुक्त है। फिनोल रेड के बिना सेचरगेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स फिनोल रेड इंडिकेटर के हस्तक्षेप को खत्म कर सकता है और रंग विकास प्रयोगों, जैसे कि रंगमिति और प्रतिदीप्ति पहचान के लिए उपयुक्त है। मानव भ्रूण स्टेम सेल संवर्धन ग्रेड सेचरगेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स का उपयोग विशेष रूप से मानव भ्रूण स्टेम सेल संवर्धन, प्रेरित प्लुरिपोटेंट फीडर-मुक्त स्टेम सेल संवर्धन के लिए किया जाता है। येसेन कई प्रकार के सेटुरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स प्रदान करता है, आप उन्हें अपने प्रयोगों के आधार पर चुन सकते हैं।

तालिका 2. सीटुरजेल™मैट्रिक्स चयन गाइड

उत्पाद का प्रकार	बिल्ली नं.	प्रोडक्ट का नाम	मैट्रिजेल कैट नं.	आवेदन दिशा
मूल सांद्रता (8-12 मिलीग्राम/एमएल)	40183ईएस	सीटुरजेल™मैट्रिक्स LDEV-मुक्त	356234/ 354234	2D और 3D संस्कृति, आक्रमण और प्रवास प्रयोगों के लिए अनुकूल, और इन विवो ट्यूमरजेनिक प्रयोगों के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है
	40184ईएस	सीटुरजेल™मैट्रिक्स फिनोल रेड-फ्री, एलडीईवी-फ्री	356237	मुख्य रूप से रंग का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है जैसे कि प्रतिदीप्ति पहचान प्रयोग, आदि
वृद्धि कारक में कमी	40185ईएस	सीटुरजेल™मैट्रिक्स GFR，LDEV-मुक्त	354230	मुख्य रूप से प्रयोग पर वृद्धि कारकों के हस्तक्षेप को बाहर करने के लिए। वृद्धि कारकों, संकेत मार्गों आदि पर संबंधित अनुसंधान के लिए लागू किया गया।
	40186ईएस	सीटुरजेल™मैट्रिक्स जीएफआर，फिनोल रेड-फ्री，एलडीईवी-फ्री	356231
उच्च सांद्रता (≥18mg/ml)	40187ईएस	सीटुरजेल™मैट्रिक्स उच्च सांद्रता，LDEV-मुक्त	354248	मुख्य रूप से एंजियोजेनेसिस, जेल एम्बोलिज़ेशन और इन विवो ट्यूमर गठन जैसे प्रयोगों में उपयोग किया जाता है (एंजियोजेनेसिस के लिए, यह अनुशंसा की जाती है कि सेट्योरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स की अंतिम सांद्रता ≥10mg/ml होनी चाहिए)
	40189ईएस (जाँच करना)	सीटुरजेल™मैट्रिक्स उच्च सांद्रता，GFR，LDEV-मुक्त	354263
	40188ईएस	सीटुरजेल™मैट्रिक्स उच्च सांद्रता，फिनोल रेड-मुक्त，LDEV-मुक्त	354262
स्टेम कोशिकाओं के लिए	40190ईएस	सीटुरजेल™मैट्रिक्स hESC-योग्य, LDEV-मुक्त	354277	मुख्य रूप से स्टेम सेल संवर्धन जैसे कि hESC, iPSC, आदि के लिए उपयोग किया जाता है।
ऑर्गेनोइड-विशिष्ट	40191ईएस (जाँच करना)	ऑर्गेनोइड कल्चर के लिए सीटुरजेल™मैट्रिक्स，फिनोल रेड-फ्री，LDEV-फ्री	356255	ऑर्गेनोइड कल्चर के लिए सीटुरजेल™ बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स