I. वेस्टर्न ब्लॉट के सिद्धांत
वेस्टर्न ब्लॉट (WB), या प्रोटीन इम्यूनोब्लॉटिंग, एंटीजन-एंटीबॉडी इंटरैक्शन के आधार पर विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक क्लासिक तकनीक है, जिसका व्यापक रूप से आणविक जीव विज्ञान, प्रतिरक्षा विज्ञान और संबंधित क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है। इसके मुख्य चरणों में शामिल हैं:
- प्रोटीन पृथक्करण:
- एसडीएस-पीएजीई विकृत प्रोटीन को आणविक भार के आधार पर अलग करता है।
- एसडीएस प्रोटीन को एकसमान ऋणात्मक आवेश से ढक देता है, जिससे संरचनात्मक प्रभाव समाप्त हो जाते हैं।
- झिल्ली स्थानांतरण:
- प्रोटीन को जेल से झिल्ली (जैसे, पीवीडीएफ या नाइट्रोसेल्यूलोज) में स्थानांतरित किया जाता है।
- एंटीबॉडी का पता लगाना:
- प्राथमिक एंटीबॉडी विशेष रूप से लक्ष्य प्रोटीन को बांधते हैं, इसके बाद एंजाइम-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी (जैसे, एचआरपी) आते हैं जो एक पता लगाने योग्य संकेत उत्पन्न करते हैं, जैसे कि केमिल्यूमिनेसेंस।
II. मानक वेस्टर्न ब्लॉट वर्कफ़्लो
| कदम | मुख्य प्रक्रियाएँ | अनुशंसित अभिकर्मक ( |
| 1. नमूना तैयार करना | RIPA लाइसिस बफर के साथ प्रोटीन निकालें; प्रोटीएज़ को रोकने के लिए PMSF जोड़ें गतिविधि. | RIPA लाइसिस बफर सीरीज, PMSF |
| 2. प्रोटीन परिमाणीकरण | बीसीए विधि का उपयोग करें (कैट#20200ES) परिमाणीकरण के लिए; मानक कमजोरीकरण बफर को नमूना बफर से मिलाएं। | बीसीए क्वांटिफिकेशन किट (कैट#20200ES/20201ईएस) |
| 3. एसडीएस-पीएजीई इलेक्ट्रोफोरेसिस | प्री-कास्ट जैल का उपयोग करें, 150 V पर तब तक चलाएं जब तक डाई जेल के तल तक न पहुंच जाए। | प्री-कास्ट जैल, एसडीएस-पीएजीई लोडिंग बफर |
| 4. झिल्ली स्थानांतरण और अवरोधन | पीवीडीएफ झिल्ली सक्रिय करें (कैट#36125ES) 1 मिनट तक मेथनॉल में भिगोकर; 300 mA पर 60 मिनट तक बर्फ के स्नान में स्थानांतरित करें; 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान (RT) पर ब्लॉक करें या तीव्र अवरोधन समाधान का उपयोग करें (कैट#36122ES) 10 मिनट के लिए। | टी.आर.उत्तर बफर, पीवीडीएफ झिल्ली श्रृंखला |
| 5. एंटीबॉडी इन्क्यूबेशन | प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 4°C पर रात भर रखें; द्वितीयक एंटीबॉडी को कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे तक रखें; TBST से 3 बार अच्छी तरह से धो लें। | एंटीबॉडी मंदक |
| 6.प्रोटीन का पता लगाना | ईसीएल के साथ विकास करें (कैट#36208ES). | ईसीएल केमिलुमिनेसेंस श्रृंखला |
चित्र 1: वेस्टर्न ब्लॉट वर्कफ़्लो
III. सामान्य मुद्दे और समाधान
| मुद्दा | संभावित कारण | समाधान |
| उच्च पृष्ठभूमि  | अपूर्ण अवरोधन | नए ब्लॉकिंग समाधान का उपयोग करें और ब्लॉकिंग समय बढ़ाएं. |
| अपर्याप्त धुलाई | गैर-विशिष्ट बंधन को हटाने के लिए धोने की आवृत्ति और अवधि बढ़ाएँ। | |
| अत्यधिक प्राथमिक एंटीबॉडी सांद्रता | एंटीबॉडी को उचित सांद्रता तक पतला करें। | |
| नमूना गुणवत्ता संबंधी मुद्दे | नमूने की शुद्धता और गुणवत्ता की जांच करें; ताजा नमूने का उपयोग करें। | |
| झिल्ली सुखाने | सुनिश्चित करें कि ऊष्मायन चरणों के दौरान झिल्ली हाइड्रेटेड रहे; प्रतिक्रिया समाधान के साथ पूर्ण संपर्क सुनिश्चित करें। | |
| कमज़ोर या कोई सिग्नल नहीं  | अपूर्ण स्थानांतरण | स्थानांतरण दक्षता की जांच करें और आवश्यकतानुसार समय समायोजित करें। |
| असक्रियित पीवीडीएफ झिल्ली | बफर में स्थानांतरित करने से पहले PVDF को सक्रिय करने के लिए मेथनॉल में भिगोएं। | |
| लक्ष्य प्रजातियों के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी का बेमेल होना | डेटाशीट की जाँच करें, इम्यूनोजेन और प्रोटीन अनुक्रमों की तुलना करें, और इसमें शामिल करें व्यापक रूप से प्रयुक्त सकारात्मक नियंत्रण (जैसे, स्तनधारी कोशिकाओं में β-एक्टिन)। | |
| प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी असंगति | सुनिश्चित करें कि द्वितीयक एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी की मेज़बान प्रजाति से मेल खाती है। | |
| अपर्याप्त एंटीबॉडी बंधन | एंटीबॉडी सांद्रता बढ़ाएं और इन्क्यूबेशन को 4°C पर बढ़ाएं (जैसे, रात भर)। | |
| कम एंटीजन स्तर | प्रति लेन कम से कम 20-30 μg प्रोटीन लोड करें; प्रोटीएज़ अवरोधक और एक सकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करें। | |
| कम लक्ष्य प्रोटीन अभिव्यक्ति | साहित्य/डेटाबेस के माध्यम से नमूने में अभिव्यक्ति की पुष्टि करें; नमूने को केंद्रित करें या उच्च-अभिव्यक्ति नियंत्रण का उपयोग करें। | |
| गैर-विशिष्ट बैंड/एकाधिक बैंड  | ओवर-पासेज्ड सेल लाइन्स प्रोटीन प्रोफाइल को बदल रही हैं | कम-मार्ग कोशिकाओं (<15 मार्ग) का उपयोग करें और प्रारंभिक-मार्ग स्टॉक के साथ समानांतर नियंत्रण चलाएं। |
| प्रोटीन का क्षरण | लाइसिस बफर में प्रोटीएज अवरोधकों को शामिल करें; -80°C पर भण्डारित करें, फ्रीज-थॉ से बचें, ताजा नमूनों का उपयोग करें। | |
| अनुवादोत्तर संशोधन | बैंड आकार को प्रभावित करने वाले संशोधनों (जैसे, यूबिक्विटिनेशन, ग्लाइकोसिलेशन) के लिए साहित्य की जांच करें। | |
| एकाधिक ब्याह वेरिएंट | साहित्य या डेटाबेस के माध्यम से स्प्लिस वेरिएंट को सत्यापित करें। | |
| प्रोटीन डिमर/मल्टीमर | एसडीएस लोडिंग बफर में ताजा β-मर्कैप्टोएथेनॉल या डीटीटी डालें। | |
| बहिर्जात प्रोटीन संदूषण | बहिर्जात प्रोटीन की जांच करें; यदि आवश्यक हो तो कोशिका रेखा बदलें। | |
| अत्यधिक नमूना लोडिंग | ग्रेडिएंट परीक्षण के माध्यम से लक्ष्य अभिव्यक्ति के आधार पर लोडिंग (20-30 μg) को अनुकूलित करें। | |
| मल्टीमर निर्माण | मल्टीमर्स को अलग करने के लिए नमूनों को 10 मिनट तक उबालें | |
| उच्च प्राथमिक एंटीबॉडी सांद्रता | अतिरिक्त बैंड से बचने के लिए सांद्रता और/या ऊष्मायन समय को कम करें। | |
| उच्च माध्यमिक एंटीबॉडी सांद्रता | कम सांद्रता और गैर-विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए केवल द्वितीयक नियंत्रण शामिल करें। | |
| अप्रतिबंधित प्रोटीन या परिवार के सदस्यों का पता लगाना | साहित्य या BLAST की समीक्षा करें; अनुशंसित कोशिका रेखाओं/ऊतकों का उपयोग करें। | |
| यदि सत्यापित हो जाए, तो हो सकता है कि आपने एक नए प्रोटीन की खोज कर ली हो! | ||
| मुस्कुराते हुए बैंड  | तेज़ माइग्रेशन, उच्च बफर तापमान, ओवरलोडिंग, कम बफर | धीमी गति से माइग्रेशन, बफर को पूर्व-शीतल करना, प्रोटीन का भार कम करना, सुनिश्चित करना कि बफर कुओं को पूरी तरह से कवर करता है। |
| फ्राउनिंग बैंड  | डिवाइस संबंधी समस्याएं (जैसे, जेल के नीचे बुलबुले) | बुलबुले को खत्म करने और जेल बहुलकीकरण को सुनिश्चित करने के लिए सेटअप को समायोजित करें। |
| टेलिंग बैंड  | खराब नमूना घुलनशीलता, गिरावट, पुन: उपयोग बफर | नमूनों को अच्छी तरह मिलाएं, ताजा नमूनों का उपयोग करें, ताजा रनिंग बफर तैयार करें। |
| डम्बल के आकार का बैंड  | असमान जेल बहुलकीकरण, अशुद्ध नमूने | एकरूपता के लिए जेल को पुनः तैयार करें; उपयोग से पहले नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें। |
| बैंड स्मियरिंग  | अत्यधिक लोडिंग, खराब जेल गुणवत्ता | नमूना मात्रा कम करें, जेल तैयारी में सुधार करें। |
| बुलबुला निशान  | स्थानांतरण के दौरान फंसी हवा | ट्रांसफर सैंडविच को इकट्ठा करते समय बुलबुले हटा दें। |
| असमान काले धब्बे  | अघुलित अवरोधक समाधान, असमान एंटीबॉडी वितरण | ब्लॉकिंग घोल को पूरी तरह से घोल लें, टीबीएसटी से 3 बार धोएं, ऊष्मायन के दौरान हिलाएं। |
| सफेद दाग  | उच्च एंटीबॉडी सांद्रता घटने वाला सब्सट्रेट | प्राथमिक/द्वितीयक एंटीबॉडी सांद्रता कम होना। |
Ⅳ.उत्पाद चयन और अनुकूलन उपकरण
संबंधित उत्पाद:
| प्रक्रियाओं | बिल्ली. नं. | प्रोडक्ट का नाम | विशेष विवरण |
| नमूना तैयार करना | 20101ईएस | RIPA लाइसिस बफर (मजबूत) | 100 एमएल |
| 20115ईएस | RIPA लाइसिस बफर (मध्यम) | 100 एमएल | |
| 20114ईएस | RIPA लाइसिस बफर (कमजोर) | 100 एमएल | |
| 20118ईएस | WB/IP परख के लिए लाइसिस बफर | 100 एमएल | |
| बीसीए प्रोटीन क्वांटिफिकेशन किट (उन्नत) | 500 टी/2500 टी/5000 टी | ||
| बीसीए प्रोटीन क्वांटिफिकेशन किट (उपयोग के लिए तैयार) | 500 टन | ||
| एसडीएस-पीएजीई इलेक्ट्रोफोरेसिस | गोल्ड बैंड प्लस 3-रंग रेगुलर रेंज प्रोटीन मार्कर (8-180 kDa) | 250 μL/2×250 μL/10×250 μL | |
| गोल्डबैंड™ 3-रंग हाई रेंज प्रोटीन मार्कर (10-245 KDa) | 2×250 μL/10×250 μL | ||
| 20328ईएस | एसडीएस-पीएजीई जेल तैयारी किट | 1 किट (30~50 जैल)/ 1 किट (150~250 जैल) | |
| पेज जेल त्वरित तैयारी किट | सांद्रता: 8%、10%、12.5%、15% | ||
| 36259ईएस-36280ईएस | प्रीकास्ट प्रोटीन प्लस जेल | सांद्रता: 8%、10%、12%、4-12%、4-20% लोडिंग वेल विकल्प: 10 कुएँ, 12 कुएँ, 15 कुएँ | |
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झिल्ली स्थानांतरण और अवरोधन | 0.45μm PVDF झिल्ली (1 रोल, 30सेमी×3 मीटर) | 1 रोल | |
| 0.22μm PVDF झिल्ली (1 रोल, 30सेमी×3 मीटर) | 1 रोल | ||
| एंटीबॉडी इन्क्यूबेशन | 36206ईएस | WB के लिए प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी मंदक | 100 एमएल/500 एमएल |
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प्रोटीन का पता लगाना | सुपर ईसीएल डिटेक्शन अभिकर्मक | 100 एमएल/500 एमएल | |
| उन्नत ईसीएल केमिलीलुमिनसेंट सब्सट्रेट किट | 100 एमएल/500 एमएल |
वीसहायता कैसे प्राप्त करें
वैयक्तिकृत समस्या निवारण या प्रोटोकॉल अनुकूलन के लिए:
- मिलने जाना:
Yeasen वेस्टर्न ब्लॉट उत्पाद पृष्ठ - ईमेल: info@yeasenbio.com
सफलता के लिए स्वर्णिम नियम: मानकीकृत प्रक्रियाएं + उच्च गुणवत्ता वाले अभिकर्मक + चरण-दर-चरण सत्यापन = पुनरुत्पादनीय WB परिणाम!