हिएफ़^™ फास्ट सेल डायरेक्ट SYBR ग्रीन डाई पर आधारित RT-qPCR किट सभी प्रकार की पशु कोशिकाओं (जैसे सेल वंश दीवार कोशिकाओं और निलंबन कोशिकाओं, प्राथमिक संस्कृति कोशिकाओं, विभिन्न स्टेम कोशिकाओं, iPS कोशिकाओं, आदि) से RNA निष्कर्षण के लिए उपयुक्त है, बिना RNA निकालने की आवश्यकता के, और सीधे qPCR अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो छोटा है, संचालित करने में आसान है, और इसकी त्रुटि दर कम है। टेम्पलेट तैयारी से लेकर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन रिएक्शन और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण तक के चरणों को पूरा करने में केवल 1.5 घंटे लगते हैं।

किट में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और फ्लोरोसेंस डिटेक्शन अभिकर्मक शामिल हैं, जिनका उपयोग अतिरिक्त अभिकर्मकों की खरीद की आवश्यकता के बिना जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

विशेष विवरण

अवयव

भंडारण

संदूषण को रोकने के लिए एफसीडी लाइसिस बफर और एफसीडी वॉशिंग बफर को पिघलाया गया और 4°C पर संग्रहीत किया गया। एफसीडी स्टॉप सॉल्यूशन、डीनेस I、4× हाईफेयर™ एफसीडी आरटी मिक्स、2× हाईएफ™ एफसीडी क्यूपीसीआर एसवाईबीआर मास्टर मिक्स को -25~-15℃ पर संग्रहित किया जाना चाहिए।

निर्देश

1. दरार उत्पादों की तैयारी

1)1. अभिकर्मक को कमरे के तापमान पर पिघलाएं, इसे उल्टा कर दें और उपयोग करने से पहले इसे धीरे से मिलाएं, और झाग से बचने के लिए इसे थोड़ा सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद उपयोग करें*।

*अभिकर्मकों को मिश्रित करने में विफलता, मिश्रण के लिए ऑसिलेटर का उपयोग, तथा अभिकर्मकों को बर्फ पर व्यवस्थित करने में विफलता से अभिक्रिया के निष्पादन में कमी आ सकती है।

2)कोशिका के प्रकार** के आधार पर, कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को इकट्ठा करने और माध्यम को अच्छी तरह से एस्पिरेट करने के लिए 2 मिनट के लिए 5000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें। यदि कोशिकाओं को 96-वेल प्लेटों में संवर्धित किया जाता है, तो माध्यम को सीधे एस्पिरेट किया जा सकता है।

​​​​​​​3) प्रत्येक वेल में 150 μL एफसीडी वॉशिंग बफर डालें, कोशिकाओं को फूंक मारकर धोएं, 2 मिनट के लिए 5000 आरपीएम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और एफसीडी वॉशिंग बफर को एस्पिरेट करें।

​​​​​​​4) प्रत्येक वेल में 48 μL FCD लिसिस बफर सॉल्यूशन और 2 μL DNase Ⅰ सॉल्यूशन डालें, कमरे के तापमान पर फूंकें और मिलाएँ, फिर इसे 5 मिनट तक खड़े रहने दें, और फिर 2 डालें।ऊष्मायन के बाद 5 μL FCD स्टॉप सॉल्यूशन****, और फिर क्लीवेज उत्पाद***** प्राप्त करने के लिए लगभग 5 बार उड़ाएं और मिलाएं।

** कोशिकाओं की संख्या के लिए मूल आवश्यकता 1 × 10 है⁴ प्रति वेल सेल, और इस किट का उपयोग 1 × 10 की सीमा में किया जा सकता है³ - 1 × 10⁶ कोशिकाएं। यदि कोशिकाओं की संख्या बड़ी है, तो एफसीडी लिसिस बफर समाधान और डीएनएसेⅠसमाधान की मात्रा को आनुपातिक रूप से उपयुक्त रूप से बढ़ाया जा सकता है।

*** सेंट्रीफ्यूजेशन की स्थितियां कोशिका दर कोशिका अलग-अलग होती हैं, इसलिए कृपया उपयोग की जा रही कोशिकाओं के लिए उपयुक्त गति से सेंट्रीफ्यूज करें।

**** 50 μL लाइसेट में 2.5 μL FCD स्टॉप सॉल्यूशन मिलाएं, और आवश्यकतानुसार FCD स्टॉप सॉल्यूशन की मात्रा बढ़ाएं।

***** सेल लाइसिस उत्पाद समाधान के दीर्घकालिक भंडारण के लिए, -20°C पर रखें।

5) 4 x हाईफ़ेयर™ FCD RT मिक्स को कमरे के तापमान पर पिघलाएं और थोड़ा उलटा करके मिलाएं, बर्फ पर रखें और नीचे दी गई तालिका के अनुसार प्रतिक्रिया प्रणाली को कॉन्फ़िगर करें:

*******अनुशंसित उपयोग स्तर 2-5 μL है, 45% से अधिक न होने का प्रयास करें।

1. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन

उपरोक्त तैयार प्रतिक्रिया समाधान को पिपेट से धीरे-धीरे मिलाएं और नीचे दी गई तालिका में दी गई प्रक्रिया के अनुसार रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया करें:

* अनुशंसित रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन तापमान 55 डिग्री सेल्सियस है। उच्च जीसी सामग्री टेम्पलेट्स या जटिल टेम्पलेट्स के लिए, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन तापमान को 60 डिग्री सेल्सियस तक बढ़ाया जा सकता है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन उत्पाद का उपयोग सीधे डाउनस्ट्रीम आरटी-क्यूपीसीआर डिटेक्शन के लिए किया जा सकता है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन सिस्टम द्वारा क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया के अवरोध से बचने और उचित सीटी मान (10-35) प्राप्त करने के लिए, उत्पाद को 10-1000 बार पतला किया जा सकता है और फिर उपयोग किया जा सकता है। यदि थोड़े समय के लिए डाउनस्ट्रीम प्रयोग नहीं किए जाते हैं, इसे भंडारण के लिए -20℃ पर रखा जा सकता है।

1. प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पी.सी.आर.

1）प्रतिक्रिया प्रणाली विन्यास

प्रतिक्रिया समाधान (बर्फ पर तैयारी) की तैयारी के लिए निम्नलिखित अनुपात की सिफारिश की जाती है।

*रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन उत्पाद के RT-qPCR वॉल्यूम के 1/10 से अधिक न जोड़ें। टेम्पलेट की उच्च सांद्रता आसानी से गैर-विशिष्ट प्रवर्धन की ओर ले जाएगी, 5-50 बार का उचित कमजोर पड़ना। टेम्पलेट की अनुशंसित मात्रा 4 μL है, 6 μL से अधिक न होने का प्रयास करें। जब प्रतिक्रिया प्रदर्शन खराब होता है, तो प्राइमर सांद्रता को 0.2-1.0 μmol/L की सीमा में समायोजित किया जा सकता है।

2）प्रतिदीप्ति मात्रात्मक पीसीआर प्रवर्धन प्रक्रिया (दो-चरण विधि)

3）फ्लोरोसेंट क्वांटिटेटिव पीसीआर के लिए तीव्र प्रवर्धन प्रक्रिया (दो-चरण विधि)

* एनीलिंग/विस्तार तापमान और अंतिम विस्तार समय को प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार उचित रूप से समायोजित किया जा सकता है। तीव्र कार्यक्रम अधिकांश जीनों के लिए उपयुक्त है, और मानक कार्यक्रम को व्यक्तिगत जटिल द्वितीयक संरचना जीनों के लिए आजमाया जा सकता है।

नोट्स

1. यह प्रॉडक्ट केवल शोध के उपयोग के लिए है।
2. कृपया अपनी सुरक्षा के लिए लैब कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनकर काम करें।

संस्करण.EN20230908

दस्तावेज़:

नियमावली

11172-Hieff™ फास्ट सेल डायरेक्ट. EN20230908.pdf