विवरण
हाईफ़ सुपरफ़ास्ट डीएनए मिथाइलेशन बिसल्फ़ाइट किट (कॉलम-आधारित) डीएनए नमूनों में अनमेथिलेटेड साइटोसिन को तेज़ी से यूरैसिल में बदल देता है, जबकि मिथाइलेटेड साइटोसिन को अपरिवर्तित छोड़ देता है। उच्च तापमान वाले बिसल्फ़ाइट उपचार के दौरान, डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए एकल स्ट्रैंड में बदल जाता है। HSO3- की उपस्थिति में, साइटोसिन अवशेषों का डीमिनेशन होता है और वे यूरैसिल में बदल जाते हैं, जबकि मिथाइलेटेड साइटोसिन अपरिवर्तित रहते हैं। बाद के पीसीआर प्रवर्धन में, यूरैसिल को थाइमिन (टी) द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। रूपांतरण प्रक्रिया में केवल 5 मिनट लगते हैं, जिसमें 100 पीजी से 2 μg तक के डीएनए इनपुट को समायोजित किया जाता है, और अनमेथिलेटेड साइटोसिन के लिए ≥99% की रूपांतरण दक्षता प्राप्त होती है। परिवर्तित डीएनए पीसीआर प्रवर्धन और एनजीएस अनुक्रमण जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है।
विशेषता
कम इनपुट: 100 pg से 2 μg तक के नमूनों को परिवर्तित करने के लिए उपयुक्त
लघु रूपांतरण समय: लगभग 5 मिनट.
न्यूनतम नमूना क्षति: रूपांतरण के बाद नमूना की अच्छी अखंडता बनाए रखना।
उच्च रूपांतरण दक्षता: रूपांतरण दर ≥99%, उच्च-जीसी क्षेत्रों में उच्च रूपांतरण दर तथा कम झूठी सकारात्मक दर।
दुर्लभ नमूनों के लिए उपयुक्त, जैसे एकल-कोशिका डीएनए मिथाइलेशन रूपांतरण।
आरएनए नमूनों के मिथाइलेशन रूपांतरण में सक्षम।
उत्पाद अवयव
| नहीं। | घटक का नाम | 12225ईएस10 | 12225ES50 |
| 12225-ए | रूपांतरण अभिकर्मक | 2 एमएल×1 | 3.3 एमएल×3 |
| 12225-बी | वॉश बफर | 1.1 एमएल×1 | 5.5 एमएल×1 |
| 12225-सी | डिसल्फोनेशन बफर | 2.2 एमएल×1 | 11 एमएल×1 |
| 12225-डी | एल्यूशन बफर | 500 μएल×1 | 1.5 एमएल×1 |
| 12225-ई | डीएनए कॉलम | 10 | 50 |
| 12225-एफ | संग्रह ट्यूब | 10 | 50 |
टिप्पणी:
प्रति बॉक्स 10 परीक्षणों के लिए: धुलाई के घोल में 4.4 मिली निर्जल इथेनॉल मिलाएं।
प्रति बॉक्स 50 परीक्षणों के लिए: धुलाई के घोल में 22 एमएल निर्जल इथेनॉल मिलाएं।
निर्जल इथेनॉल मिलाने के बाद, इसे पलटें और अच्छी तरह से मिलाएँ, फिर भविष्य में उपयोग के लिए स्टोर करें। सुनिश्चित करें कि बोतल का ढक्कन कसकर बंद हो ताकि इथेनॉल का वाष्पीकरण न हो, जो अभिकर्मक के प्रदर्शन को प्रभावित कर सकता है।
आकृति
चित्र 4. मानव जीनोमिक डीएनए नमूनों पर बिसल्फ़ाइट रूपांतरण 12225 और प्रतियोगी क्यू रूपांतरण किट दोनों का उपयोग करके किया गया था। इसके बाद, मिथाइलेशन-विशिष्ट एकल-स्ट्रैंडेड डीएनए लाइब्रेरी तैयारी किट का उपयोग लाइब्रेरी बनाने के लिए किया गया। लाइब्रेरी उपज और गुणवत्ता नियंत्रण डेटा ऊपर प्रस्तुत किए गए हैं। परिणाम दर्शाते हैं कि 12225 और प्रतियोगी क्यू किट दोनों से पूल किए गए पुस्तकालयों को अनुक्रमित करते समय, 12225 किट ने उच्च डेटा आउटपुट दिया, उच्च ऑन-टारगेट अनुपात (%) प्राप्त किया, और कम दोहराव दर (%) प्रदर्शित की।
शिपिंग और भंडारण
12225-A रूपांतरण समाधान को कमरे के तापमान पर, प्रकाश से सुरक्षित रखें। अन्य घटकों को कमरे के तापमान पर स्टोर करें। शेल्फ लाइफ 12 महीने है।
टिप्पणी:
1. डाउनस्ट्रीम प्रयोगों की सफलता सुनिश्चित करने के लिए, रूपांतरण चरण के दौरान इनपुट डीएनए की कुल मात्रा को सटीक रूप से निर्धारित करें। डीएनए मात्रा निर्धारण के लिए क्यूबिट 3.0/4.0 का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है, जिसमें A260/A280 अनुपात 1.7 और 1.9 के बीच हो। इनपुट डीएनए रेंज 100 पीजी और 2 माइक्रोग्राम के बीच होनी चाहिए, जिसमें 100 एनजी से 1 माइक्रोग्राम की इष्टतम रेंज होनी चाहिए। अपर्याप्त डीएनए इनपुट डाउनस्ट्रीम डिटेक्शन में बाधा डाल सकता है, जबकि अत्यधिक इनपुट रिकवरी और रूपांतरण दक्षता को कम कर सकता है।
2. रूपांतरण समाधान, डीसल्फोनेशन समाधान और धुलाई समाधान में वाष्पशील घटक होते हैं। उपयोग के बाद, तुरंत ढक्कन को कस लें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
3. रूपांतरण के बाद के नमूनों के लिए, तुरंत डाउनस्ट्रीम प्रयोगों के साथ आगे बढ़ें। अल्पकालिक भंडारण के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और दीर्घकालिक भंडारण के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
4. अपनी सुरक्षा और स्वास्थ्य के लिए, ऑपरेशन के दौरान लैब कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें।
5. यह उत्पाद केवल अनुसंधान के लिए है!
निर्देश
अभिकर्मकों और उपभोग्य सामग्रियों की तैयारी: 1.5 एमएल स्टेराइल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब, एंजाइम मुक्त पानी, पूर्ण इथेनॉल, पीसीआर ट्यूब;
एल बाइसल्फाइट रूपांतरण:
1) परीक्षण किए जाने वाले नमूनों की संख्या के अनुसार संबंधित बाँझ पीसीआर ट्यूब तैयार करें, और निम्नलिखित तालिका के अनुसार प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार करें:
2) परिवर्तन प्रणाली
| अवयव | आयतन |
| डीएनए | 100 पीजी-2 μg (से 20 μL) |
| रूपांतरण बफर | 180 μएल |
| कुल मात्रा | 200 μएल |
उपरोक्त प्रणाली या भंवर को उड़ाने और मिश्रण करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें और इसे 5 सेकंड के लिए मिलाएं, फिर इसे थोड़े समय के लिए अपकेंद्रित्र करें, और प्रतिक्रिया समाधान को पीसीआर ट्यूब के नीचे तक अपकेंद्रित्र करें।
वी नोट: 1. इस समय, पीसीआर ट्यूब में प्रतिक्रिया समाधान की कुल मात्रा 200 μL है। रूपांतरण को और अधिक पूर्ण बनाने के लिए, प्रतिक्रिया समाधान को बराबर भागों में विभाजित किया जाना चाहिए और चरण 2 में उड़ाने और मिश्रण करने के बाद एक नई बाँझ पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित किया जाना चाहिए, और रूपांतरण प्रक्रिया को चलाया जाना चाहिए। रूपांतरण के बाद, दो पीसीआर ट्यूबों में प्रतिक्रिया समाधान शुद्धिकरण के लिए एक ही शुद्धिकरण स्तंभ में संयुक्त किए गए थे।
2. यदि नमूने का आयतन 20 से 40 μL के बीच है, तो कुल आयतन 200 μL बनाए रखने के लिए रूपांतरण विलयन का आयतन कम करें।
3. यदि नमूने का आयतन 50 μL है, तो 150 μL रूपांतरण विलयन मिलाया जाता है, कुल आयतन 200 μL पर बनाए रखा जाता है, तथा रूपांतरण समय 6-10 मिनट तक बढ़ा दिया जाता है।
3) सीटी रूपांतरण कार्यक्रम की स्थापना
| तापमान | समय |
| 98 ℃ | 5 मिन |
| 4 ℃ | ∞ |
पीसीआर ट्यूब को प्रतिक्रिया करने के लिए पूर्व निर्धारित प्रोग्राम के साथ पीसीआर उपकरण पर रखा जाता है।
एल शुद्धिकरण
1) टी200 μL स्थानांतरित करें परिवर्तन इसका समाधान पीमूत्रीकरण स्तंभएस, 30-60 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज 13000 जीछानने के बाद छान लें और शुद्धिकरण कॉलम को उसमें डाल दें। सीसंग्रह ट्यूबएस दोबारा;
2) 100 μL जोड़ें वॉश बफर में शुद्धिकरण स्तंभ (पुष्टि करें कि पूर्ण इथेनॉल मिलाया गया है), 30-60 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज करें 13000 जीछानने के बाद छान लें और शुद्धिकरण कॉलम को उसमें डाल दें। सीसंग्रह ट्यूबएस दोबारा;
3) 200 μL जोड़ें डिसल्फोनेशन बफर में शुद्धिकरण स्तंभ , और प्रतिक्रिया को कमरे के तापमान पर 20 मिनट तक रहने दें। प्रतिक्रिया के बाद, 30-60 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज करें 13000 जी, छानना त्यागें, और रखें शुद्धिकरण स्तंभ में सीसंग्रह ट्यूबएस दोबारा;
4) 200 μL जोड़ें वॉश बफर तक शुद्धिकरण स्तंभ, 30-60 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज 13000 जी छानने वाले पदार्थ को त्याग दें, और रखें पीमूत्रीकरण स्तंभएस में सीसंग्रह ट्यूबएस दोबारा;
5) चरण 4) को एक बार दोहराएं;
6) स्थानांतरित करें शुद्धिकरण स्तंभ तैयार 1.5 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, 10-30 μL जोड़ें एल्यूशन बफर कवर खोलने और सुखाने के बाद फिल्टर झिल्ली के केंद्र में ले जाएँ, और इकट्ठा करें डीएनए कमरे के तापमान पर 1 मिनट तक खड़े रहने और 13000 पर 1 मिनट तक सेंट्रीफ्यूज करने के बाद जी;
7) स्टोर करें डीएनए अस्थायी रूप से -20 ℃ पर। दीर्घकालिक भंडारण के लिए, कृपया स्टोर करें डीएनए -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें और अनावश्यक रूप से बार-बार जमने और पिघलने से बचें।
नोट: शुद्धिकृत रूपांतरण उत्पाद का उपयोग बाद की पीसीआर प्रतिक्रिया या अनुक्रमण प्रक्रिया में सीधे किया जा सकता है।
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