विवरण
उत्पाद वर्णन
Hieff NGS™ अल्टिमा डुअल-मोड RNA लाइब्रेरी प्रेप किट, Illumina® और MGI® सीक्वेंसिंग प्लेटफ़ॉर्म के लिए एक संपूर्ण RNA सीक्वेंसिंग लाइब्रेरी निर्माण किट है, जिसमें RNA विखंडन अभिकर्मक, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन अभिकर्मक, पारंपरिक और स्ट्रैंड-विशिष्ट ds-cDNA संश्लेषण अभिकर्मक और लाइब्रेरी प्रवर्धन अभिकर्मक शामिल हैं। अनुक्रमण लाइब्रेरी का निर्माण mRNA शुद्धिकरण किट या rRNA हटाने वाली किट के बाद किया जा सकता है। दो-स्ट्रैंड संश्लेषण मॉड्यूल पारंपरिक लाइब्रेरी या स्ट्रैंड-विशिष्ट लाइब्रेरी की आवश्यकता को पूरा करने के लिए दो बफ़र्स से सुसज्जित है। उनमें से, स्ट्रैंड-विशिष्ट दो-स्ट्रैंड संश्लेषण बफ़र में dTTP को dUTP से बदल दिया जाता है, इसलिए dUTP को cDNA के दूसरे स्ट्रैंड में जोड़ा जा सकता है। इस किट में उपयोग किया जाने वाला उच्च-निष्ठा वाला DNA पॉलीमरेज़ यूरैसिल युक्त DNA टेम्प्लेट को प्रवर्धित नहीं कर सकता है, जिससे स्ट्रैंड विशिष्टता प्राप्त होती है। प्रदान किए गए सभी अभिकर्मकों को सख्त गुणवत्ता नियंत्रण और कार्यात्मक सत्यापन से गुजरना पड़ा है, जिससे पुस्तकालय निर्माण की स्थिरता और पुनरुत्पादन क्षमता को अधिकतम सीमा तक सुनिश्चित किया जा सके।
कार्य प्रवाह
उत्पाद घटक
| अवयव | 12308ईएस24 | 12308ES96 | |||
| 12308-ए | 2× फ्रैग/प्राइम बफर | 250 μएल | 930 μएल | ||
| 12308-बी | 1 स्ट्रैंड एंजाइम मिक्स | 48 μएल | 192 μएल | ||
| 12308-सी | स्ट्रैंड विशिष्टता अभिकर्मक | 150 μएल | 580 μएल | ||
| 12308-डी | 2nd स्ट्रैंड बफर (dNTP) | 720 μएल | 2×1440 μL | ||
| 12308-ई | 2nd स्ट्रैंड बफर (dUTP) | 720 μएल | 2×1440 μL | ||
| 12308-एफ | 2nd स्ट्रैंड एंजाइम मास्टर मिक्स | 120 μएल | 480 μएल | ||
| 12308-जी | लिगेशन बढ़ाने वाला | 720 μएल | 2×1440 μL | ||
| 12308-एच | नवीन T4 डीएनए लाइगेस | 120 μएल | 480 μएल | ||
| 12308-आई | 2×सुपर कैनेस® II उच्च-निष्ठा मिश्रण | 600 μएल | 2×1200 μL | ||
| 12308-के | न्यूक्लिऐस मुक्त H2O | 300 μएल | 1000 μएल | ||
नोट: यह किट Illumina और MGI दोनों प्लेटफार्मों के साथ संगत है, लेकिन अतिरिक्त Illumina या एमजीआई प्राइमर मिक्स (कैट# 13335 इल्युमिना के लिए प्राइमर मिक्स और MGI के लिए Cat# 13334 प्राइमर मिक्स ) है आवश्यक।
शिपिंग और भंडारण
बॉक्स I में Hieff NGS™ अल्टिमा डुअल-मोड mRNA लाइब्रेरी प्रेप किट घटकों को आइस पैक के साथ भेजा जाता है और उन्हें एक वर्ष के लिए 2-8°C पर संग्रहीत किया जा सकता है।
बॉक्स II में Hieff NGS™ अल्टिमा डुअल-मोड mRNA लाइब्रेरी प्रेप किट घटकों को सूखी बर्फ के साथ भेजा जाता है और उन्हें एक वर्ष के लिए -20°C पर संग्रहीत किया जा सकता है।
चेतावनी
1 ऑपरेशन
1.1 अपनी सुरक्षा और स्वास्थ्य के लिए, कृपया इस उत्पाद के साथ काम करते समय प्रयोगशाला कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने जैसे व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें। यह उत्पाद केवल शोध के लिए है!
1.2 घटकों को कमरे के तापमान पर पिघलाएँ। कई बार ऊपर-नीचे करके अच्छी तरह मिलाएँ, थोड़ी देर घुमाएँ और उपयोग के लिए बर्फ़ पर रखें।
1.3 प्रत्येक चरण की प्रतिक्रिया को गर्म ढक्कन वाले थर्मल साइक्लर में करने की अनुशंसा की जाती है। थर्मल साइक्लर को उपयोग से पहले निर्धारित तापमान पर गर्म किया जाना चाहिए।
1.4 आरएनएएस संदूषण से मुक्त आपूर्ति और प्रयोगात्मक क्षेत्र की नियमित सफाई आवश्यक है।
1.5 अनुचित संचालन से एरोसोल संदूषण की संभावना बहुत अधिक हो सकती है, जिससे परिणाम की सटीकता प्रभावित हो सकती है। पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण क्षेत्रों और पीसीआर उत्पाद शुद्धिकरण परख क्षेत्रों के अनिवार्य भौतिक अलगाव की सिफारिश की जाती है। लाइब्रेरी निर्माण के लिए विशेष पिपेट जैसे उपकरणों से सुसज्जित।
2 एडाप्टर लिगेशन
2.1 इल्युमिना या एमजीआई लांग एडाप्टर (बारकोडेड एडाप्टर) किट और शॉर्ट एडाप्टर किट ग्राहकों के लिए उनकी प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार चुनने के लिए उपलब्ध हैं।
2.2 उच्च गुणवत्ता वाले, वाणिज्यिक एडाप्टर का चयन करने की सिफारिश की गई थी। यदि स्व-निर्मित एडाप्टर का चयन किया जाता है, तो कृपया NGS प्राइमर संश्लेषण में अनुभव वाली कंपनी को सौंपें और सख्त संदूषण नियंत्रण की आवश्यकता पर टिप्पणी करें। इसके अलावा, एक साफ बेंच में डीएनए एनीलिंग समाधान तैयार करने और क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए हर बार केवल एक प्रकार के एडाप्टर को संचालित करने की सिफारिश की जाती है।
2.3 कृपया एडाप्टरों को बर्फ पर या 4°C पर पिघलाएं; कमरे के तापमान पर संचालन करते समय, एडाप्टरों को विकृत होने से बचाने के लिए प्रयोगशाला का तापमान 25°C से अधिक नहीं होना चाहिए।
2.4 एडाप्टर की सांद्रता सीधे लिगेशन दक्षता और लाइब्रेरी उपज को प्रभावित करती है। किट में जोड़े गए एडाप्टर की मात्रा 5 μl तय की गई है। एडाप्टर को 0.1×TE बफर के साथ पतला करने की सिफारिश की जाती है और पतला एडाप्टर 48 घंटों के लिए 4°C पर संग्रहीत किया जा सकता है। तालिका 1 में इनपुट आरएनए की विभिन्न मात्राओं के लिए अनुशंसित एडाप्टर मात्रा सूचीबद्ध की गई है।
तालिका 1-1 विभिन्न इनपुट आरएनए के लिए अनुशंसित इल्युमिना एडाप्टर राशि
| कुल आरएनए इनपुट करें | Illumina एडाप्टर स्टॉक सांद्रता |
| 10 एनजी | 1 माइक्रोएम |
| 100 एनजी | 1.5 माइक्रोएम |
| 500 एनजी | 3 माइक्रोएम |
| ≥1 माइक्रोग्राम | 5 माइक्रोएम |
तालिका 1-2 विभिन्न इनपुट आरएनए के लिए अनुशंसित एमजीआई® एडाप्टर राशि
| कुल आरएनए इनपुट करें | एमजीआई एडाप्टर स्टॉक सांद्रता |
| 100-499 एनजी | 2 माइक्रोन |
| 500-4000 एनजी | 5 माइक्रोएम |
*एडाप्टर के उपयोग को विभिन्न प्रकार के कुल आरएनए नमूनों और इनपुट मात्रा के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
3 लाइब्रेरी प्रवर्धन
3.1 प्रथम पीढ़ी के डीएनए पॉलीमरेज़ के आधार पर, किट में उच्च-निष्ठा डीएनए पॉलीमरेज़ ने अपनी प्रवर्धन एकरूपता में काफी सुधार किया है और कोई प्रवर्धन पूर्वाग्रह प्रदर्शित नहीं करता है।
3.2 यदि इंडेक्स्ड एडाप्टर (जिसे लम्बा एडाप्टर या बड़ा Y एडाप्टर भी कहते हैं) को लक्ष्य डीएनए से जोड़ा जाता है, तो इस किट में दिए गए प्राइमर मिश्रण का उपयोग प्रवर्धन के लिए किया जा सकता है; यदि डीएनए को जोड़ने के लिए "छोटा एडाप्टर" या "छोटा Y एडाप्टर" का उपयोग किया जाता है, तो प्रवर्धन के लिए इंडेक्स प्राइमर की आवश्यकता होती है।
3.3 प्रवर्धन चक्र संख्याओं को सख्ती से नियंत्रित किया जाना चाहिए। अपर्याप्त प्रवर्धन से लाइब्रेरी यील्ड कम हो सकती है; अधिक प्रवर्धन से पूर्वाग्रह, त्रुटियाँ, दोहराए गए रीड, काइमेरिक उत्पाद और विस्तार उत्परिवर्तन का संचय हो सकता है। तालिका 2 में पीसीआर प्रवर्धन के लिए अनुशंसित चक्र संख्याएँ सूचीबद्ध हैं।
तालिका 2 आरएनए लाइब्रेरी उत्पन्न करने के लिए चक्रों की अनुशंसित संख्या*
| कुल आरएनए इनपुट करें | चक्रों की संख्या | |
| गैर-फंसे | फंसे | |
| 10 एनजी | 15 | 15 |
| 100 एनजी | 14 | 14 |
| 500 एनजी | 12 | 13 |
| 1 माइक्रोग्राम | 11 | 12 |
नोट:*लाइब्रेरी की उपज केवल इनपुट मात्रा और प्रवर्धन चक्रों की संख्या से संबंधित नहीं है लेकिन नमूनों की गुणवत्ता, विखंडन की स्थिति और छंटाई की स्थिति से भी प्रभावित होता है। पुस्तकालय निर्माण की प्रक्रिया में, वास्तविक स्थिति के अनुसार सबसे उपयुक्त स्थितियों का चयन करें।
4 मनका-आधारित डीएनए सफाई और आकार चयन
4.1 लाइब्रेरी निर्माण प्रक्रिया में कई चरण हैं जिनके लिए डीएनए शुद्धिकरण चुंबकीय मोतियों की आवश्यकता होती है। हम डीएनए शुद्धिकरण और आकार चयन के लिए Hieff NGS™ डीएनए चयन मोती (येसेन कैट#12601) या AMPure® XP चुंबकीय मोती (बेकमैन कैट#A63880) की सलाह देते हैं।
4.2 चुंबकीय मोतियों को उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर संतुलित किया जाना चाहिए, अन्यथा उपज कम हो जाएगी और आकार-चयन प्रभाव प्रभावित होगा।
4.3 चुंबकीय मोतियों को उपयोग से पहले भंवर या पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाया जाना चाहिए।
4.4 सुपरनेटेंट को स्थानांतरित करते समय मोतियों को चूसें नहीं, मोतियों की थोड़ी सी मात्रा भी निम्नलिखित प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकती है।
4.5 80% इथेनॉल ताजा तैयार किया जाना चाहिए, अन्यथा यह पुनर्प्राप्ति दक्षता को प्रभावित करेगा।
4.6 उत्पाद को निकालने से पहले चुंबकीय मोतियों को कमरे के तापमान पर सुखाया जाना चाहिए। अपर्याप्त सूखापन आसानी से इथेनॉल अवशेषों को बाद की प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करने का कारण बनेगा; अत्यधिक सूखापन चुंबकीय मोतियों को दरार करने और शुद्धिकरण उपज को कम करने का कारण बनेगा। आम तौर पर, मोतियों को पूरी तरह से सूखने देने के लिए कमरे के तापमान पर 3-5 मिनट तक सुखाना पर्याप्त होता है।
4.7 यदि आवश्यक हो, तो TE बफर में निकाले गए शुद्ध या आकार-चयनित DNA नमूनों को 4°C पर 1-2 सप्ताह के लिए या -20°C पर एक महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है।
5 पुस्तकालय गुणवत्ता विश्लेषण
5.1 सामान्यतः, निर्मित लाइब्रेरी की गुणवत्ता का मूल्यांकन लंबाई वितरण और सांद्रता पहचान द्वारा किया जा सकता है।
5.2 लाइब्रेरी सांद्रता का पता लगाना: डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए फ्लोरोसेंट रंगों पर आधारित विधियां, जैसे कि क्यूबिट®, पिकोग्रीन®, आदि; qPCR पर आधारित पूर्ण मात्रा का ठहराव।
5.3 स्पेक्ट्रल डिटेक्शन पर आधारित विधियां, जैसे नैनोड्रॉप®, आदि लाइब्रेरी सांद्रता का पता लगाने के लिए लागू नहीं है।
5.4 लाइब्रेरी सांद्रता का पता लगाने के लिए qPCR की सिफारिश की जाती है: क्यूबिट®, पिकोग्रीन® और डबल-स्ट्रैंडेड डीएनए फ्लोरोसेंट डाई पर आधारित अन्य विधियों के माध्यम से, यह एक छोर पर एडेप्टर से जुड़े उत्पादों, दोनों छोर पर एडेप्टर से जुड़े नहीं उत्पादों और अन्य अपूर्ण डबल-स्ट्रैंड उत्पादों के बीच प्रभावी रूप से अंतर नहीं कर सकता है। qPCR का पूर्ण परिमाणीकरण PCR प्रवर्धन के सिद्धांत पर आधारित है, जो केवल नमूने के दोनों सिरों पर एडेप्टर की पूरी लाइब्रेरी (वह लाइब्रेरी जिसे अनुक्रमित किया जा सकता है) को परिमाणित करता है, गैर-अनुक्रमण लाइब्रेरी के हस्तक्षेप को छोड़कर जो सिंगल-एंडेड या डबल-एंडेड सिरों पर एडेप्टर से जुड़े नहीं हैं।
5.5 लाइब्रेरी लंबाई वितरण का पता लगाने का कार्य एजिलेंट बायोएनालाइजर 2100 और केशिका वैद्युतकणसंचलन या माइक्रोफ्लुइडिक्स के सिद्धांत पर आधारित अन्य उपकरणों द्वारा किया जा सकता है।
दस्तावेज़:
12308ES-Hieff NGS™ अल्टिमा डुअल-मोड RNA लाइब्रेरी प्रेप किट-Ver.EN20230327.pdf
उद्धरण एवं संदर्भ:
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एच वांग, पी झाओ, वाई हे, वाई सु, एक्स झोउ… - इंटरनेशनल जर्नल ऑफ मॉलिक्यूलर साइंस, 2023 आईएफ:5.6
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उपवास
यह उत्पाद केवल शोध उद्देश्यों के लिए है और मनुष्यों या जानवरों में चिकित्सीय या नैदानिक उपयोग के लिए अभिप्रेत नहीं है। उत्पाद और सामग्री येसेन बायोटेक्नोलॉजी के स्वामित्व वाले पेटेंट, ट्रेडमार्क और कॉपीराइट द्वारा संरक्षित हैं। ट्रेडमार्क प्रतीक मूल देश को इंगित करते हैं, जरूरी नहीं कि सभी क्षेत्रों में पंजीकरण हो।
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येसेन नैतिक विज्ञान के प्रति समर्पित हैं, उनका मानना है कि हमारे शोध में सुरक्षा और नैतिक मानकों को सुनिश्चित करते हुए महत्वपूर्ण प्रश्नों का समाधान किया जाना चाहिए।