हिएफ़ एनजीएस^टीएम डीएनए लाइब्रेरी प्रेप किट एक नई पीढ़ी की लाइब्रेरी निर्माण किट है जिसे विशेष रूप से विकसित और डिज़ाइन किया गया है इल्लुमिना® और एमजीआई® अनुक्रमण मंचलाइब्रेरी कंस्ट्रक्शन किट की पिछली पीढ़ी के आधार पर, यह उत्पाद पिछले संस्करणों की तुलना में एंड रिपेयर, डीए-टेलिंग और एडेप्टर लिगेशन में उच्च दक्षता प्रदर्शित करता है। उच्च-निष्ठा एंजाइम प्रवर्धन की एकरूपता और निष्ठा में महत्वपूर्ण रूप से सुधार करता है। किट अधिकांश डीएनए नमूना प्रकारों के साथ संगत है, जिसमें जानवरों/पौधों/सूक्ष्मजीवों से मानक जीनोमिक डीएनए, एफएफपीई नमूने, सीएफडीएनए और चिप डीएनए शामिल हैं।

विशेष विवरण

अवयव

भंडारण

इस उत्पाद को -25~-15℃ तापमान पर 1 घंटे तक संग्रहित किया जाना चाहिए वर्ष।

नोट्स

1. ऑपरेशन के बारे में

1. कृपया लैब कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनकर काम करें，आपकी सुरक्षा के लिए.

2. घटकों को कमरे के तापमान पर पिघलाएँ। पिघलने के बाद, भँवर द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, ट्यूब को थोड़ी देर घुमाएं और बाद में उपयोग के लिए उन्हें बर्फ पर रखें।

3. प्रत्येक चरण के प्रतिक्रिया समाधान को तैयार करते समय, अच्छी तरह से मिश्रण करने या धीरे से हिलाने के लिए पिपेट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। जोरदार हिलाने से लाइब्रेरी आउटपुट में कमी आ सकती है।

4. क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए फ़िल्टर किए गए पाइपेट टिप्स का उपयोग करना अत्यधिक अनुशंसित है। विभिन्न नमूनों को संसाधित करते समय पाइपेट टिप्स को बदलना सुनिश्चित करें।

5. अनुचित संचालन से एरोसोल संदूषण की संभावना बहुत अधिक हो सकती है, जिससे परिणाम की सटीकता प्रभावित हो सकती है। पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण क्षेत्रों और पीसीआर उत्पाद शुद्धिकरण परख क्षेत्रों के अनिवार्य भौतिक अलगाव की सिफारिश की जाती है। लाइब्रेरी निर्माण के लिए विशेष पिपेट जैसे उपकरणों से सुसज्जित।प्रत्येक क्षेत्र की नियमित सफाई के लिए सतहों को 0.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट या 10% ब्लीच से पोंछें

6. यह उत्पाद केवल अनुसंधान के लिए है।

2. डीएनए विखंडन

1. यह किट या तो यांत्रिक रूप से खंडित डीएनए या एंजाइम द्वारा खंडित डीएनए के साथ संगत है।

2. किट 100 पीजी - 1000 एनजी इनपुट डीएनए के साथ संगत है। A260/A280 = 1.8-2.0 के साथ उच्च गुणवत्ता वाले इनपुट डीएनए का उपयोग करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है। तालिका 1 में इनपुट डीएनए की अनुशंसित मात्रा सूचीबद्ध है।

तालिका 1 इनपुट डीएनए की अनुशंसित मात्रा

टिप्पणीजब इनपुट डीएनए खराब गुणवत्ता वाला हो या डीएनए आकार का चयन आवश्यक हो, तो इनपुट डीएनए की मात्रा को तदनुसार बढ़ाया जाना चाहिए।

3. "इनपुट डीएनए" विशेष रूप से अंतिम मरम्मत/डीए टेलिंग के लिए तैयार डीएनए नमूनों को संदर्भित करता है।

4. यदि इनपुट डीएनए नमूने में धातु-चेलेटिंग एजेंट जैसे लवणों की उच्च सांद्रता होती है, तो विखंडन के बाद बीड्स-शुद्धिकरण/आकार-चयन चरण की सिफारिश की जाती है। लवण अंत मरम्मत और डीए-टेलिंग सहित निम्नलिखित प्रतिक्रियाओं की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं।यदि आप यांत्रिक विखंडन विधि का उपयोग कर रहे हैं, तो कृपया विखंडन के लिए डीएनए नमूनों को निष्फल अति-शुद्ध पानी के बजाय TE बफर में निकालें। यदि आप लाइब्रेरी तैयारी के लिए आगे बढ़ने से पहले बीड्स क्लीन-अप या आकार-चयन किए बिना एंजाइमेटिक विखंडन विधि का उपयोग कर रहे हैं, तो कृपया सुनिश्चित करें कि उपयोग किए जाने वाले स्टॉप बफर में मेटल-चेलेटिंग एजेंट की अधिकता न हो। अन्यथा, कृपया लाइब्रेरी तैयारी के लिए आगे बढ़ने से पहले खंडित नमूनों को साफ करें या आकार का चयन करें और उन्हें TE बफर या निष्फल अति-शुद्ध पानी (≤50 μL) में निकालें।

3. एडाप्टर लिगेशन

1. इल्युमिना या एमजीआई लांग एडाप्टर (बारकोडेड एडाप्टर) किट और शॉर्ट एडाप्टर किट ग्राहकों के लिए उनकी प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार चयन करने के लिए उपलब्ध हैं।

2. उच्च गुणवत्ता वाले, वाणिज्यिक एडाप्टर का चयन करने की सिफारिश की गई थी। यदि स्व-निर्मित एडाप्टर का चयन किया जाता है, तो कृपया NGS प्राइमर संश्लेषण में अनुभव वाली कंपनी को सौंपें और सख्त संदूषण नियंत्रण की आवश्यकता पर टिप्पणी करें। इसके अलावा, एक साफ बेंच में डीएनए एनीलिंग समाधान तैयार करने और क्रॉस-संदूषण को रोकने के लिए हर बार केवल एक प्रकार के एडाप्टर को संचालित करने की सिफारिश की जाती है।

3. कृपया एडाप्टरों को बर्फ पर या 4°C पर पिघलाएं; कमरे के तापमान पर संचालन करते समय, एडाप्टरों को विकृत होने से बचाने के लिए प्रयोगशाला का तापमान 25°C से अधिक नहीं होना चाहिए।

4. एडाप्टर की गुणवत्ता और सांद्रता सीधे लिगेशन दक्षता और लाइब्रेरी यील्ड को प्रभावित करेगी। एडाप्टर की बहुत अधिक सांद्रता एडाप्टर डिमर गठन को बढ़ावा देती है जबकि बहुत कम एडाप्टर लिगेशन दर और लाइब्रेरी यील्ड को कम करता है। एडाप्टर का उपयोग करते समय इनपुट डीएनए राशि के अनुसार TE बफर के साथ संगत कमजोरीकरण। तालिका 2 -5 इस किट का उपयोग करके विभिन्न इनपुट डीएनए मात्राओं के लिए अनुशंसित एडाप्टर कमजोरीकरण विधियों को सूचीबद्ध करता है।

तालिका 2 अनुशंसित Illumina™ विभिन्न इनपुट डीएनए के लिए एडाप्टर राशि

टेबल तीन अनुशंसित MGI™ विभिन्न इनपुट डीएनए के लिए एडाप्टर राशि

तालिका 4 अनुशंसित Illumina™ विभिन्न इनपुट डीएनए के लिए UMI एडाप्टर राशि

तालिका 5 अनुशंसित MGI™ विभिन्न इनपुट डीएनए के लिए UMI एडाप्टर राशि

4. मनका-आधारित डीएनए सफाई और आकार चयन

1. डीएनए आकार का चयन अंत मरम्मत/डीए-टेलिंग से पहले, एडाप्टर लिगेशन के बाद, या प्रवर्धन के बाद किया जा सकता है।

2. यदि इनपुट डीएनए मात्रा 50 एनजी से अधिक है तो एडाप्टर लिगेशन के तुरंत बाद आकार-चयन करने की सिफारिश की जाती है; अन्यथा, कृपया प्रवर्धन के बाद आकार-चयन करें।

3. लिगेशन एन्हांसर में PEG की उच्च सांद्रता होती है, जो सटीक आकार-चयन पर महत्वपूर्ण प्रभाव डाल सकती है। इस प्रकार, यदि आकार-चयन एडाप्टर लिगेशन के ठीक बाद किया जाना है, तो आकार-चयन से पहले बीड्स क्लीन-अप चरण जोड़ने की दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है। आकार चयन चरण सीधे किया जा सकता है यदि इसे अंतिम मरम्मत/डीए-टेलिंग से पहले या बाद में किया जाता है पुस्तकालय प्रवर्धन.

4. चुंबकीय मोतियों को उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर संतुलित किया जाना चाहिए, अन्यथा उपज कम हो जाएगी और आकार चयन प्रभाव प्रभावित होगा।

5. चुंबकीय मोतियों को उपयोग से पहले भंवर या पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिश्रित किया जाना चाहिए।

6. सतह पर तैरने वाले तरल को स्थानांतरित करते समय मोतियों को चूसें नहीं, मोतियों की अल्प मात्रा भी निम्नलिखित प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकती है।

7. 80% इथेनॉल ताजा तैयार किया जाना चाहिए, अन्यथा यह पुनर्प्राप्ति दक्षता को प्रभावित करेगा।

8. सटीक आकार-चयन के लिए, 100 μL से अधिक की मात्रा से शुरू करने की अनुशंसा की जाती है। यदि कम है, तो अल्ट्रा-शुद्ध पानी के साथ मात्रा को 100 μL तक लाने की अनुशंसा की जाती है।

9. उत्पाद को निकालने से पहले चुंबकीय मोतियों को कमरे के तापमान पर सुखाया जाना चाहिए। अपर्याप्त सूखापन आसानी से इथेनॉल अवशेषों को बाद की प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करने का कारण बनेगा; अत्यधिक सूखापन चुंबकीय मोतियों को दरार करने और शुद्धिकरण उपज को कम करने का कारण बनेगा। आम तौर पर, मोतियों को पूरी तरह से सूखने देने के लिए कमरे के तापमान पर 3-5 मिनट तक सुखाना पर्याप्त होता है।

10. यदि आवश्यक हो, तो शुद्ध या आकार-चयनित डीएनए नमूनों को 0.1× टीई बफर को 4°C पर 1-2 सप्ताह तक या -20°C पर एक महीने तक भंडारित किया जा सकता है।

5. लाइब्रेरी प्रवर्धन

1. लाइब्रेरी एम्पलीफिकेशन करना है या नहीं, यह डीएनए इनपुट की मात्रा, एडेप्टर के प्रकार, अनुक्रमण डेटा एप्लीकेशन आदि पर निर्भर करता है। आंशिक एडेप्टर का उपयोग करते समय एम्पलीफिकेशन चरण की आवश्यकता होती है। पूर्ण लंबाई वाले एडेप्टर का उपयोग करते समय, यदि इनपुट डीएनए <200 एनजी है, तो एम्पलीफिकेशन करने की सिफारिश की जाती है; अन्यथा, एम्पलीफिकेशन आवश्यक नहीं है।

2. प्रवर्धन चक्र संख्याओं को सख्ती से नियंत्रित किया जाना चाहिए। अपर्याप्त प्रवर्धन से लाइब्रेरी यील्ड कम हो सकती है; अधिक प्रवर्धन से पूर्वाग्रह, त्रुटियाँ, दोहराए गए रीड और काइमेरिक उत्पाद बढ़ सकते हैं। तालिका 6 1 μg की लाइब्रेरी उपज को लक्षित करते हुए अनुशंसित चक्र संख्याओं को सूचीबद्ध करता है।

तालिका 6 उत्पन्न करने के लिए अनुशंसित चक्रों की संख्या 1,000 एनजी लाइब्रेरी उपज

टिप्पणी:

1.तालिका 6 लगभग 200 बीपी के उच्च गुणवत्ता वाले इनपुट डीएनए परीक्षणों का उपयोग करके लूप मापदंडों की संख्या को दर्शाता है। एफएफपीई डीएनए गुणवत्ता बहुत भिन्न होती है, और जब डीएनए गुणवत्ता खराब होती है या लाइब्रेरी की लंबाई लंबी होती है, तो पर्याप्त लाइब्रेरी प्राप्त करने के लिए चक्रों की संख्या को उचित रूप से बढ़ाने की आवश्यकता होती है।

2.मैंयदि पुस्तकालय निर्माण प्रक्रिया के दौरान आकार का चयन आवश्यक हो, तो पुस्तकालय प्रवर्धन के लिए उच्च चक्र संख्या की सिफारिश की जाती है; अन्यथा, कम चक्र संख्या की सिफारिश की जाती है।

3.मैंयदि अपूर्ण एडाप्टर का उपयोग किया जाता है, तो पूर्ण एडाप्टर बनाने के लिए कम से कम 2 चक्रों को प्रवर्धित करने की आवश्यकता होती है।

6. पुस्तकालय गुणवत्ता विश्लेषण

1. निर्मित पुस्तकालयों की गुणवत्ता का विश्लेषण आम तौर पर सांद्रता और आकार वितरण को मापकर किया जाता है।

2. लाइब्रेरी की सांद्रता को फ्लोरोसेंट-आधारित विधियों जैसे कि क्यूबिट और पिकोग्रीन या qPCR द्वारा मापा जा सकता है।

3. नैनोड्रॉप जैसे अवशोषण-आधारित परिमाणीकरण विधियों का उपयोग करना अनुशंसित नहीं है।

4. लाइब्रेरी क्वांटिफिकेशन के लिए qPCR विधि का उपयोग करने की अनुशंसा की जाती है: क्यूबिट और पिकोग्रीन जैसी फ्लोरोसेंट-आधारित विधियाँ अपूर्ण dsDNA संरचनाओं (एडेप्टर के बिना या केवल एक छोर को एडॉप्टर से लिगेट किए गए इंसर्ट) को पूर्ण लाइब्रेरी से अलग नहीं कर सकती हैं। qPCR विधि केवल उन पूर्ण लाइब्रेरी को बढ़ाएगी और मापेगी जिनके दोनों छोर एडॉप्टर (सीक्वेंसेबल लाइब्रेरी) से लिगेट किए गए हैं, इस प्रकार लोडिंग के लिए अधिक सटीक माप प्रदान करती है।

5.लाइब्रेरी के आकार वितरण का विश्लेषण एजिलेंट बायोएनालाइजर या केशिका वैद्युतकणसंचलन या माइक्रोफ्लुइडिक्स के सिद्धांतों पर आधारित अन्य उपकरणों का उपयोग करके किया जा सकता है।

7. अन्य सामग्री

1. डीएनए शुद्धिकरण चुंबकीय मोती: हाईफ़ एनजीएस^टीएम डीएनए चयन मोती (Yeasen कैट#12601) या AMPure^® एक्सपी बीड्स (A63880) या अन्य समकक्ष उत्पाद।

2. एडाप्टर: इल्युमिना के लिए पूर्ण एडाप्टर: Yeasen कैट#13519-13520; 384 डुअल सीडीआई प्राइमर्स: Yeasen बिल्ली#12412~बिल्ली#12413; 384 अद्वितीय दोहरे सूचकांक (यूडीआई) प्राइमर्स: Yeasen बिल्ली#12312~बिल्ली#12315; यूएमआई यूडीआई एडाप्टर: Yeasen कैट#13370~कैट#13371; एमजीआई के लिए पूर्ण एडाप्टर: Yeasen कैट#13360-13362. डीएनए प्राइमर मिक्स:बिल्ली#12190 या बिल्ली#12191.

3. लाइब्रेरी गुणवत्ता विश्लेषण: एजिलेंट 2100 बायोएनालाइजर डीएनए 1000 चिप/ उच्च संवेदनशीलता चिप या अन्य समतुल्य उत्पाद; लाइब्रेरी मात्रात्मक अभिकर्मक।

4. अन्य सामग्रियां: पूर्ण इथेनॉल, स्टेराइल अल्ट्राशुद्ध जल, कम प्रतिधारण पिपेट टिप्स, पीसीआर ट्यूब, चुंबकीय स्टैंड, थर्मल साइक्लर, आदि।

निर्देश

स्टेप 1। मरम्मत/डीए-टेलिंग समाप्त करें

1. पिघलना तालिका में उल्लिखित अभिकर्मक 7 अभिकर्मकों को अच्छी तरह से मिलाने के लिए उन्हें पलट दें और बाद में उपयोग के लिए बर्फ पर रख दें।

2. तालिका के अनुसार अभिकर्मकों को इकट्ठा करें 7 बर्फ पर.

मेज़ 7 अंतिम मरम्मत/डीए-टेलिंग प्रतिक्रिया प्रणाली

3. धीरे से पाइपिंग या हिलाकर मिलाएं, घोल को नीचे लाने के लिए थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।

4. ट्यूब को थर्मोसाइक्लर में रखें और तालिका 8 के अनुसार प्रोग्राम सेट करें।

तालिका 8 मरम्मत/डीए-टेलिंग समाप्त करें प्रतिक्रिया कार्यक्रम

चरण दो। एडाप्टर लिगेशन

1. तालिका 2 के अनुसार एडाप्टर को उचित सांद्रता तक पतला करें-5.

2. पिघलना तालिका में उल्लिखित अभिकर्मक 9 अभिकर्मकों को अच्छी तरह से मिलाने के लिए उन्हें पलट दें और बाद में उपयोग के लिए बर्फ पर रख दें।

3. तालिका के अनुसार अभिकर्मकों को इकट्ठा करें 9 बर्फ पर.

तालिका 9 एडाप्टर लिगेशन प्रतिक्रिया प्रणाली

टिप्पणी*लिगेशन एन्हांसर चिपचिपा है। कृपया इसे उलटकर या ऊपर की ओर घुमाकर अच्छी तरह मिलाएं और उपयोग से पहले संक्षेप में अपकेंद्रित्र.

**इल्लुमिना की मूल सांद्रता^टीएम YEASE का एडाप्टर 15 μM है। कृपया इनपुट राशि के अनुसार एडाप्टर को पतला करें और एडाप्टर का आयतन 5 μL पर स्थिर रखें।

**एमजीआई की मूल सांद्रता^टीएम YEASE का एडाप्टर 10 है μM. कृपया इनपुट राशि के अनुसार एडाप्टर को पतला करें और एडाप्टर का आयतन 5 μL पर स्थिर रखें।

4. धीरे-धीरे ऊपर-नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं, तथा ट्यूब के किनारों से सारा तरल इकट्ठा करने के लिए थोड़ी देर नीचे घुमाएं।

5. तालिका 10 में दिखाए अनुसार नमूने को पहले से गरम किए गए थर्मल साइक्लर में इनक्यूबेट करें और एडाप्टर कनेक्शन प्रतिक्रिया निष्पादित करें.

तालिका 10 एडाप्टर लिगेशन प्रतिक्रिया कार्यक्रम

चरण 3. सफाई या आकार चयन के बाद एडाप्टर लिगेशन

यह चरण चरण 2 में उत्पाद को शुद्ध करने या आकार का चयन करने के लिए है चुंबकीय मोतियों के साथ। शुद्धिकरण से अवशेष एडाप्टर, एडाप्टर डिमर या अन्य अनुपयोगी उत्पाद हटाये जा सकते हैं।

क्लीआएन एडेप्टर-लिगेटेड डीएनए का निर्माण

1. तैयारी: हाईफ़ एनजीएस लें^टीएम डीएनए सिलेक्शन बीड्स को फ्रिज से बाहर निकालें, और कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए संतुलित करें। 80% इथेनॉल को ताज़ा तैयार करें।

2. मोतियों को उलटकर या ऊपर करके अच्छी तरह मिलाएं।

3. 88 जोड़ें μएल हिएफ़ एनजीएस^टीएम डीएनए चयन मोती (0.8 ×, मोती: डीएनए = 0.8: 1) एडाप्टर-लिगेटेड उत्पाद युक्त ट्यूब में, अच्छी तरह से मिलाएं और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।

4. घोल को नीचे लाने के लिए थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को चुंबकीय रैक पर रखें। चुंबकीय मोती पूरी तरह से अवशोषित होने के बाद (लगभग 5 मिनट), तरल को सावधानीपूर्वक हटा दें।

5. ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड पर रखें, ट्यूब में सीधे 200 μL ताजा तैयार 80% इथेनॉल डालें। कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए इनक्यूबेट करें और ध्यान से तरल निकालें।

6. दोहराना चरण 5 पुनः.

7. ट्यूब को चुंबकीय स्टैण्ड पर रखें, ढक्कन खोलें और मोतियों को तब तक सुखाएं जब तक कि वे टूट न जाएं (5 मिनट से अधिक नहीं)।

8. निक्षालन के लिए ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड से हटा लें और डीएनए को हटा दें

1). यदि उत्पाद का आकार चुनने की आवश्यकता नहीं है, तो 21 μL ddH जोड़ें₂O सीधे। 10 बार ऊपर-नीचे घुमाकर या पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएँ। कमरे के तापमान पर 5 मिनट तक इनक्यूबेट करें। ट्यूब को थोड़ी देर घुमाएँ और इसे चुंबकीय स्टैंड पर रखें। जब घोल साफ हो जाए (लगभग 5 मिनट), चुंबकीय मोतियों को छुए बिना सावधानी से 20 μL सुपरनेटेंट को एक नई पीसीआर ट्यूब में डालें।

2). यदि उत्पाद का आकार चुनना हो तो 102 μL ddH मिलाएं₂O सीधे। 10 बार ऊपर-नीचे घुमाकर या पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं। कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ट्यूब को थोड़ी देर घुमाएं और इसे चुंबकीय स्टैंड पर रखें। जब घोल साफ हो जाए (लगभग 5 मिनट), चुंबकीय मोतियों को छुए बिना सावधानी से 100 μL सुपरनेटेंट को एक नई पीसीआर ट्यूब में ट्रांसफर करें।

टिप्पणीयदि शुद्ध उत्पाद को संग्रहीत करने की आवश्यकता है, तो इसे टीई बफर के साथ निकाला जा सकता है।

एडेप्टर-लिगेटेड डीएनए का आकार चयन

1.तैयारी: हाईफ़ एनजीएस लें^टीएम डीएनए सिलेक्शन बीड्स को फ्रिज से बाहर निकालें, और कमरे के तापमान पर कम से कम 30 मिनट के लिए संतुलित करें। 80% इथेनॉल को ताज़ा तैयार करें।

2. मोतियों को उलटकर या ऊपर करके अच्छी तरह मिलाएं।

3. लक्षित आकारों के आधार पर, तालिका के अनुसार 100 μL शुद्ध डीएनए टेम्प्लेट में मोतियों का पहला दौर जोड़ें 1110 बार वोर्टेक्सिंग या पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह मिलाएं।

मेज़ 11 अनुशंसित मोती: मोती-आधारित आकार चयन के लिए डीएनए अनुपात

टिप्पणीतालिका में "×" डीएनए नमूने की मात्रा को दर्शाता है। उदाहरण के लिए, यदि लाइब्रेरी की सम्मिलित लंबाई 250 बीपी है और नमूना डीएनए की मात्रा 100 μL है, तो छंटाई के पहले दौर में उपयोग किए जाने वाले चुंबकीय मोतियों की मात्रा 0.7×100 μL = 70 μL है; छंटाई के दूसरे दौर में उपयोग किए जाने वाले चुंबकीय मोतियों की मात्रा 0.20× 100 μL = 20 μL है। तालिका में अनुशंसित मनका मात्रा एडाप्टर-लिगेटेड डीएनए के लिए है। यदि आकार चयन प्रक्रिया बंधाव से पहले की जाती है, तो कृपया Hieff NGS के विनिर्माण प्रोटोकॉल देखें^टीएम डीएनए चयन मोती (कैट#12601).

4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट तक रखें।

5. ट्यूब को थोड़ी देर घुमाएँ और इसे चुंबकीय स्टैंड पर रखें। जब घोल साफ हो जाए (लगभग 5 मिनट), तो सुपरनेटेंट को एक नई पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।

6. चरण 5 से नमूने में चयन मोतियों का दूसरा दौर जोड़ें तालिका के अनुसार 11कम से कम 10 बार ऊपर-नीचे घुमाकर या पाइपिंग करके अच्छी तरह मिलाएं।

7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट तक रखें।

8. घोल को नीचे लाने के लिए थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, और सेंट्रीफ्यूज ट्यूब को चुंबकीय रैक पर रखें। चुंबकीय मोतियों के पूरी तरह से सोख लिए जाने के बाद (लगभग 5 मिनट), तरल को सावधानीपूर्वक हटा दें।

9. ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड पर रखें, ट्यूब में सीधे 200 μL ताजा तैयार 80% इथेनॉल डालें। कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए इनक्यूबेट करें और ध्यान से तरल निकालें।

10. दोहराना चरण 9 दोबारा।

11। ट्यूब को चुंबकीय स्टैण्ड पर रखें, ढक्कन खोलें और मोतियों को तब तक सुखाएं जब तक कि वे टूट न जाएं (5 मिनट से अधिक नहीं)।

12. निक्षालन के लिए ट्यूब को चुंबकीय स्टैंड से हटा लें, और सीधे 21 μL ddH जोड़ें₂ओ. भंवर या पाइपिंग द्वारा ऊपर-नीचे अच्छी तरह से मिलाएं और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। (नोट: यदि शुद्ध उत्पाद को संग्रहीत करने की आवश्यकता है, तो कृपया TE बफर में निकालें।) ट्यूब को थोड़ी देर के लिए घुमाएं और इसे चुंबकीय स्टैंड पर तब तक रखें जब तक कि तरल साफ न हो जाए (लगभग 5 मिनट)। मोतियों को छुए बिना 20 μL सुपरनेटेंट को एक नई पीसीआर ट्यूब में सावधानी से स्थानांतरित करें।

चरण 4 लाइब्रेरी प्रवर्धन

यह चरण पीसीआर प्रवर्धन द्वारा शुद्ध या आकार-चयनित उत्पादों को समृद्ध कर सकता है।

1. तालिका 12 में सूचीबद्ध अभिकर्मकों को पिघलाएं, पलटें और अच्छी तरह से मिलाएं, और बाद में उपयोग के लिए उन्हें बर्फ पर रखें।

2. निम्नलिखित प्रतिक्रिया को एक जीवाणुरहित पीसीआर ट्यूब में एकत्रित करें।

तालिका 12 एडाप्टर-लिगेटेड डीएनए पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली

[टिप्पणी]: * यदि सम्पूर्ण एडाप्टर का उपयोग किया गया हो, हिएफ़ एनजीएस^टीएम प्राइमर मिक्स (Yeasen कैट#12190 या कैट#12191) आवश्यकता में; यदि अपूर्ण एडाप्टर का उपयोग किया जाता है (Cat#12412~Cat#12413, Cat#12312~बिल्ली#12315, कैट#13370~कैट#13371), कृपया किट निर्देशों का संदर्भ लें और प्रवर्धन के लिए किट में दिए गए इंडेक्स प्राइमर का उपयोग करें।

3. पाइपिंग या हिलाकर धीरे-धीरे मिलाएं, तथा घोल को नीचे लाने के लिए थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।

4. ट्यूब को थर्मोसाइक्लर में डालें और तालिका 13 के अनुसार प्रोग्राम सेट करें प्रवर्धन शुरू करने के लिए.

तालिका 13 पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रिया कार्यक्रम

चरण 5 प्रवर्धन के बाद सफाई/आकार चयन

स्वच्छ ऊपर के चरणों का संदर्भ लें कदम 3. हिएफ एनजीएस^टीएम डीएनए चयन मोती (0.9×, मोती:डीएनए=0.9:1) का उपयोग पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करने के लिए किया जाता है। यदि आकार चयन की आवश्यकता है, तो कृपया देखें कदम 3.

चरण 6 अंतिम पुस्तकालयों का गुणवत्ता नियंत्रण

निर्मित लाइब्रेरी की गुणवत्ता का मूल्यांकन आम तौर पर सांद्रता और आकार वितरण को मापकर किया जाता है। विवरण के लिए, कृपया नोट 6 देखें।