विवरण
सेल काउंटिंग किट-8 (CCK-8) WST-8 (2-(2-मेथॉक्सी-4-नाइट्रोफेनिल)-3-(4-नाइट्रोफेनिल)-5-(2,4-डिसल्फोफेनिल)-2H-टेट्राजोलियम मोनोसोडियम साल्ट) अभिकर्मक पर आधारित एक तेज़ और अत्यधिक संवेदनशील पहचान किट है। WST-8 MTT का एक उन्नत अभिकर्मक है और इसे माइटोकॉन्ड्रिया में डिहाइड्रोजनेज द्वारा अत्यधिक पानी में घुलनशील नारंगी-पीले फॉर्मेज़न में बदला जा सकता है। उत्पन्न फॉर्मेज़न की मात्रा जीवित कोशिकाओं की संख्या के समानुपातिक है। माइक्रोप्लेट रीडर द्वारा पता लगाए गए 450nm पर फॉर्मेज़ान का OD मान अप्रत्यक्ष रूप से व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या का संकेत दे सकता है। इस किट का व्यापक रूप से ड्रग स्क्रीनिंग, सेल प्रसार और साइटोटॉक्सिसिटी परख, ट्यूमर ड्रग संवेदनशीलता परीक्षण और जैविक कारकों की गतिविधि का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है।
सीसीके-8 विधि के लाभ
1. सीसीके-8 विधि की अन्य कोशिका प्रसार/विषाक्तता पहचान विधियों के साथ तुलना।
| पता लगाने की विधि | एमटीटी विधि | एक्सटीटी विधि | डब्लूएसटी - 1 विधि | सीसीके 8 विधि |
|---|---|---|---|---|
| फॉर्मेज़ान उत्पाद की जल घुलनशीलता | कम (घुलने के लिए कार्बनिक विलायक मिलाने और फिर परीक्षण करने की आवश्यकता है) | उच्च | उच्च | उच्च |
| उत्पाद विशेषताएँ | पाउडर | घोल की 2 बोतलें | समाधान | 1 बोतल घोल |
| उपयोग की विधि | घोल में मिलाएं और प्रयोग करें | घोल उपयोग से ठीक पहले तैयार किया गया था। | अलग सोच | अलग सोच |
| पता लगाने की संवेदनशीलता | उच्च | बहुत ऊँचा | बहुत ऊँचा | उच्च |
| खोज समय | लंबा | छोटा | छोटा | कम से कम |
| पता लगाने की तरंगदैर्ध्य | 560-600 एनएम | 420-480 एनएम | 420-480 एनएम | 430-490 एनएम |
| cytotoxicity | उच्च विषाक्तता, कोशिका आकृति विज्ञान का पूर्ण रूप से लुप्त होना | कम विषाक्तता, कोशिका आकारिकी अपरिवर्तित | कम विषाक्तता, कोशिका आकृति विज्ञान अपरिवर्तित | कम विषाक्तता, कोशिका आकारिकी अपरिवर्तित |
| अभिकर्मक स्थिरता | सामान्य | कम | सामान्य | उच्च |
| थोक नमूना परीक्षण | संभव | उपयुक्त | उपयुक्त | उपयुक्त |
2. फिनोल रेड और सीरम CCK-8 का पता लगाने में बाधा नहीं डालते हैं।
3. चूंकि सीसीके-8 अभिकर्मक की साइटोटॉक्सिसिटी बहुत कम है, इसलिए सीसीके-8 अभिकर्मक जोड़ने के बाद अलग-अलग समय पर माइक्रोप्लेट रीडर से बार-बार रीडिंग करके इष्टतम माप समय निर्धारित किया जा सकता है।
शिपिंग और भंडारण
उत्पाद को दो वर्षों तक सूखी और अंधेरी जगह में -25~-15ºC तापमान पर भंडारित किया जा सकता है।
सावधानियां
1. पहले प्रयोग में, प्लेटेड कोशिकाओं की इष्टतम संख्या और CCK-8 अभिकर्मक के इष्टतम ऊष्मायन समय को निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है।
2. यदि संभव हो, तो प्रतिकृति कुओं के बीच भिन्नता को कम करने के लिए मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करें। प्रयोग में बुलबुले से बचें क्योंकि बुलबुले OD रीडिंग में बाधा डालेंगे। CCK-8 अभिकर्मक जोड़ते समय, इसे संस्कृति माध्यम में डालने के बजाय संस्कृति प्लेट की दीवार के करीब जोड़ने की सिफारिश की जाती है।
3. श्वेत रक्त कोशिकाओं को अधिक लम्बे समय तक विकसित होने की आवश्यकता हो सकती है।
4. मानक 96-वेल प्लेट का उपयोग करते समय, प्लेट की गई कोशिकाओं की संख्या कम से कम 1,000 कोशिकाएँ/वेल (100 μL) होती है। श्वेत रक्त कोशिकाओं के लिए पहचान संवेदनशीलता अपेक्षाकृत कम है, इसलिए कम से कम 2,500 कोशिकाएँ/वेल (100 μL) प्लेट करने की अनुशंसा की जाती है। यदि 24-वेल या 6-वेल प्लेट का उपयोग कर रहे हैं, तो प्रत्येक वेल के लिए कोशिकाओं की संगत संख्या की गणना करें और CCK-8 अभिकर्मक की उचित मात्रा जोड़ें (प्लेट के प्रत्येक वेल में जोड़े गए CCK-8 अभिकर्मक की मात्रा संस्कृति माध्यम की मात्रा का 10% है)।
5.यदि 450 एनएम फिल्टर उपलब्ध नहीं है, तो 430-490 एनएम के बीच अवशोषण वाले फिल्टर का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन 450 एनएम फिल्टर उच्चतम पहचान संवेदनशीलता प्राप्त कर सकता है।
6. फिनोल रेड माप को प्रभावित नहीं करता है क्योंकि माध्यम में फिनोल रेड के अवशोषण को रिक्त समूह के अवशोषण को घटाकर समाप्त किया जा सकता है।
7. अपनी सुरक्षा और स्वास्थ्य के लिए, कृपया प्रयोग करते समय लैब कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें।
निर्देश
I. एक मानक वक्र बनाएं
1. सेल सस्पेंशन तैयार करें, सेल घनत्व निर्धारित करें, और फिर कोशिकाओं को प्लेट करें।
2. एक निश्चित अनुपात (जैसे 1:2 अनुपात) के अनुसार संवर्धन माध्यम के साथ कोशिकाओं को क्रमिक रूप से पतला करें जिससे कोशिका सांद्रता प्रवणता बने, आम तौर पर 3-5 कोशिका सांद्रता प्रवणताएं, प्रत्येक सांद्रता के लिए 3-6 प्रतिकृति कुएं।
3. प्लेटिंग के बाद, कोशिकाओं को 2-4 घंटे तक संवर्धित करें ताकि वे चिपक सकें। फिर, CCK-8 अभिकर्मक जोड़ें, एक निश्चित अवधि के लिए इनक्यूबेट करें और OD मान मापें। सेल संख्या को X-अक्ष और OD मान को Y-अक्ष के रूप में मानक वक्र के रूप में प्लॉट करें। इस मानक वक्र के अनुसार, किसी अज्ञात नमूने में सेल संख्या निर्धारित की जा सकती है (इस मानक वक्र का उपयोग करने का आधार यह है कि प्रयोगात्मक स्थितियाँ सुसंगत होनी चाहिए)।
II. कोशिका व्यवहार्यता परख
1. 96-वेल प्लेट में प्लेट सेल (100 μL/वेल) रखें। प्लेट को इनक्यूबेटर (37°C, 5% CO) में रखें2) को कुछ समय के लिए पूर्व-ऊष्मायन हेतु रखा जाता है।
2. प्रत्येक वेल में 10 μL CCK-8 अभिकर्मक डालें (वेल में बुलबुले न बनने दें, क्योंकि वे OD रीडिंग में बाधा डालते हैं) और धीरे से मिलाएं।
3. प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें और 1-4 घंटे तक इनक्यूबेट करें।
4. माइक्रोप्लेट रीडर से 450 एनएम पर अवशोषण को मापें।
5. यदि OD मान तुरंत नहीं मापा जाता है, तो प्रत्येक वेल में 0.1 M HCl घोल या 1% w/v SDS घोल के 10 μL डालें, प्लेट को ढँक दें और कमरे के तापमान पर प्रकाश से सुरक्षा के साथ स्टोर करें। अवशोषण मान 24 घंटे के भीतर नहीं बदलेगा।
III. कोशिका प्रसार और साइटोटॉक्सिसिटी परख
1. 96-वेल प्लेट में प्लेट सेल (100 μL/वेल) रखें। प्लेट को इनक्यूबेटर (37°C, 5% CO) में रखें2) को प्री-इन्क्यूबेशन के लिए 24 घंटे के लिए रखा जाता है।
2. परीक्षण किए जाने वाले पदार्थ की विभिन्न सांद्रताओं की 10 μL मात्रा प्लेट में डालें।
3. प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें और एक निश्चित अवधि (जैसे 6, 12, 24, या 48 घंटे) के लिए इनक्यूबेट करें।
4. प्रत्येक वेल में 10 μL CCK-8 अभिकर्मक डालें (वेल में बुलबुले न बनने दें, क्योंकि वे OD रीडिंग में बाधा डालते हैं) और धीरे से मिलाएं।
5. प्लेट को इनक्यूबेटर में रखें और 1-4 घंटे तक इनक्यूबेट करें।
6. माइक्रोप्लेट रीडर से 450 एनएम पर अवशोषण को मापें।
7. यदि OD मान तुरंत नहीं मापा जाता है, तो प्रत्येक वेल में 0.1 M HCl घोल या 1% w/v SDS घोल के 10 μL डालें, प्लेट को ढक दें और कमरे के तापमान पर प्रकाश से सुरक्षा के साथ स्टोर करें। अवशोषण मान 24 घंटे के भीतर नहीं बदलेगा।
टिप्पणी: यदि पदार्थ ऑक्सीकरण या अपचयन कर रहा है, तो पदार्थ के प्रभाव को समाप्त करने के लिए CCK-8 अभिकर्मक को जोड़ने से पहले पुराने संवर्धन माध्यम को नए माध्यम से बदलें (पुराने माध्यम को हटा दें, कोशिकाओं को दो बार ताजा माध्यम से धो लें, और फिर ताजा माध्यम डालें)।यदि पदार्थ में ही केवल ए थोड़ा अवशोषण मूल्य पर प्रभाव को कम करने के लिए, संवर्धन माध्यम को बदलने की कोई आवश्यकता नहीं है और पदार्थ के साथ एक रिक्त समूह के अवशोषण मूल्य को घटाकर पदार्थ के प्रभाव को समाप्त किया जा सकता है।
गणना सूत्र
कोशिका जीवित रहने की दर =[(एसी) /(बीसी)] x100%
अवरोध दर =[(बी.ए.) /(बी.सी.)] x100%
उत्तर: प्रायोगिक समूह का अवशोषण (कोशिकाओं, सीसीके-8 अभिकर्मक, तथा परीक्षण किये जाने वाले पदार्थ युक्त संवर्धन माध्यम का अवशोषण)
बी: नियंत्रण समूह का अवशोषण (कोशिकाओं, सीसीके-8 अभिकर्मक युक्त संवर्धन माध्यम का अवशोषण)
सी: रिक्त समूह का अवशोषण (सीसीके-8 अभिकर्मक युक्त संवर्धन माध्यम का अवशोषण)
उद्धरण
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