निर्देश

1. प्रयोग से पहले की तैयारियाँ

1) प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले आवश्यक अभिकर्मकों और सामग्रियों को तैयार करें।

2) की उपयुक्तता की पुष्टि करें qPCR उपकरण

इस किट का उपयोग नीचे दिए गए qPCR उपकरणों पर किया जा सकता है:

1. बायो-रेड: CFX96
2. थर्मो साइंटिफिक: 7500 रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम; क्वांटस्टूडियो™5;
3. प्रयोग विधि

1) डीएनए निष्कर्षण

हम उपयोग करने की सलाह देते हैं ' चुंबकीय अवशिष्ट डीएनए नमूना तैयारी किट' (कैट#18461ES के लिए मैनुअल निष्कर्षण और Cat#18462ES के लिए ऑटो निष्कर्षण) के लिए डीएनए निष्कर्षण, आप कर सकना मिलने जाना ' http:/www.yeasenbiotech.com '  के लिए

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किट (कैट#40619ES) में एक आंतरिक नियंत्रण (IC) होता है। यदि DNA निष्कर्षण से पहले नमूनों में IC को जोड़ा जाता है, तो यह पूरी प्रक्रिया (DNA निष्कर्षण और qPCR प्रतिक्रिया शामिल) को सत्यापित कर सकता है। यदि qPCR मास्टर मिक्स में IC को जोड़ा जाता है

सीधे, आईसी केवल qPCR नियंत्रण के रूप में कार्य करेगा।

2）qPCR मिक्स तैयारी

1. नमूना मात्रा के अनुसार जिसमें सकारात्मक नियंत्रण (पीसीएस), कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी), नकारात्मक शामिल थे  अभिक्रियाओं की संख्या की गणना करने के लिए नियंत्रण समाधान (एनसीएस) और टेस्टसैंपल (टीएस) का उपयोग करें। समानांतर में 2 अभिक्रियाएँ तैयार करें

प्रत्येक नमूना आम तौर पर.

* पीसीएस：सकारात्मक नियंत्रण समाधान: एनटीसी: नहीं खाका नियंत्रण; एनसीएस: नकारात्मक नियंत्रण समाधान; टीएस: टेस्ट नमूना. वहाँ है नहीं ज़रूरत को अभिनय करना

नमूना निष्कर्षण के लिए पीसी और एनटीसी, लेकिन एनसीएस और टी हैं आवश्यकता है।

प्रतिक्रिया कुएँ（M1）=（1×NCS + एन×टीएस） ×2

प्रतिक्रिया कुएँ（M2）=（1×PCS + 1×NTC） ×2

प्रतिक्रिया कुएँ（M3）=（1×PCS + 1×NTC+ N×TS） ×2

1. प्रयोग डिजाइन और नीचे दी गई तालिकाओं के अनुसार आवश्यक मात्रा में अभिकर्मकों को बर्फ पर पहले से पिघला लें।
2. प्रतिक्रियाओं की संख्या के अनुसार qPCR मिक्स की मात्रा की गणना करें। कृपया ध्यान दें, यदि किट का उपयोग उत्पाद रिलीज़ जैसी GMP गतिविधियों के लिए किया जाएगा, तो हम तैयारी के लिए तालिका 1 और 2 का उपयोग करने की सलाह देते हैं; यदि किट होगी अभी अनुसंधान के लिए उपयोग किया जाता है और मूल्यांकन के बाद निष्कर्षण से पहले आईसी जोड़ने की कोई आवश्यकता नहीं है, तो तालिका 3 का पालन करें

कृपया ध्यान दें कि सभी M1, M2 और M3 नहीं हैं को जरूरत होना तैयार करना।

तालिका 1 M1 के लिए qPCR मिक्स सिस्टम

*द विन्यास प्रणाली में मेज़ 1 है आधारित पर  आधार वह मैं सी है जोड़ा पहले निष्कर्षण के लिए दोनों एनसीएस और टीएस, तो यह है नहीं ज़रूरी

को जोड़ना मैं सी कब क्यूपीसीआर मिक्स तैयारी. आईसी जोड़ना तरीका पहले निष्कर्षण: सबसे पहले, पतला मैं सी द्वारा 20 बार साथ डीएनए मंदक, और जोड़ना 1μएल

पतला मैं सी में प्रत्येक 100μएल परीक्षा नमूना के लिए  आगे निष्कर्षण.

**यह किट करता है नहीं रोकना रॉक्स संदर्भ रंग. अगर रॉक्स संदर्भ डाई है आवश्यकता है के लिए  असली समय पीसीआर एम्पलीफायरों वह आप हैं वर्तमान में का उपयोग करते हुए, 50×आरओएक्स संदर्भ रंग (कैट#10200ES) है अनुशंसित के लिए उपयोग। में यह मामला, जोड़ा आयतन है 0.8μएल, जैसा दिखाया में मेज़ 1. अगर का उपयोग करते हुए अन्य

ब्रांडों का रॉक्स उत्पाद, कृपया संदर्भ देना को उनका निर्देश के लिए रॉक्स जोड़ना।अगर नहीं रॉक्स संदर्भ डाई है आवश्यक, जोड़ा आयतन है 0 μएल.

तालिका 2 M2 के लिए qPCR मिक्स सिस्टम

*द विन्यास प्रणाली में मेज़ 2 है आधारित पर  आधार वह मैं सी है नहीं जोड़ा में पीसी और एनटीसी पहले निष्कर्षण, इसलिए मैं सी आवश्यकताओं को होना जोड़ा दौरान क्यूपीसीआर मिक्स तैयारी. आईसी जोड़ना तरीका बाद निष्कर्षण: पतला मैं सी द्वारा 100 बार साथ डीएनए घुलानेवाला और जोड़ना 1μएल पतला मैं सी में

प्रत्येक क्यूपीसीआर मिक्स प्रणाली।

**यह किट करता है नहीं रोकना रॉक्स संदर्भ रंग. अगर रॉक्स संदर्भ डाई है आवश्यकता है के लिए  असली समय पीसीआर एम्पलीफायरों वह आप हैं वर्तमान में का उपयोग करते हुए, 50×आरओएक्स संदर्भ रंग (कैट#10200ES) है अनुशंसित के लिए उपयोग। में यह मामला, जोड़ा आयतन है 0.8μएल, जैसा दिखाया में मेज़ 1. अगर का उपयोग करते हुए अन्य

ब्रांडों का रॉक्स उत्पाद, कृपया संदर्भ देना को उनका निर्देश के लिए रॉक्स इसके अलावा. अगर नहीं रॉक्स संदर्भ डाई है आवश्यक है, जोड़ा आयतन है 0 μएल.

तालिका 3 M3 के लिए qPCR मिक्स सिस्टम

*द विन्यास प्रणाली में मेज़ 3 है आधारित पर  आधार वह मैं सी है नहीं जोड़ा को नमूने पहले निष्कर्षण, तो मैं सी आवश्यकताओं को होना जोड़ा    दौरान क्यूपीसीआर मिक्स तैयारी. आईसी जोड़ना तरीका बाद निष्कर्षण: पतला मैं सी द्वारा 100 बार साथ डीएनए घुलानेवाला और जोड़ना 1μएल में प्रत्येक क्यूपीसीआर मिक्स

प्रणाली।

**यह किट करता है नहीं रोकना रॉक्स संदर्भ रंग. अगर रॉक्स संदर्भ डाई है आवश्यकता है के लिए  असली समय पीसीआर एम्पलीफायरों वह आप हैं वर्तमान में का उपयोग करते हुए, 50×आरओएक्स संदर्भ रंग (कैट#10200ES) है अनुशंसित के लिए उपयोग। में यह मामला, जोड़ा आयतन है 0.8μएल, जैसा दिखाया में मेज़ 1. अगर का उपयोग करते हुए अन्य

ब्रांडों का रॉक्स उत्पाद, कृपया संदर्भ देना को उनका निर्देश के लिए रॉक्स इसके अलावा. अगर नहीं रॉक्स संदर्भ डाई है आवश्यक है, जोड़ा आयतन है 0 μएल.

3）टेम्प्लेट जोड़ना

1. पर्याप्त हिलाते हुए qPCR मिश्रण को मिलाएं, कम गति पर सेंट्रीफ्यूज करें और कैप से अवशिष्ट तरल एकत्र करें

के नीचे तक ट्यूब.

1. 20 जोड़ें प्रत्येक रिएक्शन ट्यूब/वेल में μL qPCR मिक्स डालें। कृपया ध्यान दें कि प्रत्येक में संबंधित qPCR मिक्स डालें

नमूना ट्यूबों का चयन करें और त्रुटियां जोड़ने से बचें।

1. ट्यूब/वेल्स में टेम्पलेट्स जोड़ें जिसमें qPCR मिक्स शामिल है। टेम्पलेट्स जोड़ने के लिए तालिका 4 देखें।

मेज़ 4 टेम्पलेट्स जोड़ना

*हम डीएनए निष्कर्षण के लिए एनसीएस के टेम्पलेट के रूप में डीएनए कमजोरीकरण बफर (40619-ई) का उपयोग करने की सलाह देते हैं।

**द कुल प्रतिक्रिया आयतन में प्रत्येक ट्यूब/कुआं है 40 μएल.

***ढकना  नली ढक्कन या  थाली फिल्म. टालना प्रभावित  रोशनी संकेत कृपया पढें लेना देखभाल नहीं को निशान  नली ढक्कन या पतली परत

या यहां तक ​​की रगड़ना  पतली परत बार बार साथ ए खुरचनी.

****सेंट्रीफ्यूज  प्रतिक्रिया नली या थाली संक्षिप्त पर कम रफ़्तार बाद खाके जोड़ना. बाद पर्याप्त हिलना और मिश्रण, दोहराएँ अपकेंद्रित्र

पर कम रफ़्तार को इकट्ठा करना  तरल से  ढक्कन या दीवार को  नीचे. से बचें बबल कब ऑपरेशन. आधारभूत इच्छा होना असर पड़ा अगर  मिक्स

है नहीं मिश्रित अच्छा, तो यह कदम है बहुत महत्वपूर्ण को ए अच्छा प्रयोग परिणाम।

4）qPCR प्रोग्राम सेटिंग

1. प्रोग्राम फ़ाइल सेटिंग्स

उदाहरण (7500 रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम उपकरण और रियल-टाइम पीसीआर सॉफ्टवेयर v2.4):

उपकरण प्रकार：7500 (96 कुएँ)

प्रयोग प्रकार：मात्रा-मानक वक्र；

रसायन विज्ञान: Taqman® अभिकर्मक

रैंप स्पीड: मानक (एक रन पूरा करने में ~2 घंटे)

1. लक्ष्य चैनल सेटिंग्स

में "परिभाषित करना लक्ष्यों को और नमूने" का "थाली स्थापित करना", बनाएं ए लक्ष्य 1 चैनल (एफएएम), चुनना परिवार जैसा  रिपोर्टिंग प्रतिदीप्ति समूह और एमजीबी या कोई नहीं शमन के रूप में रोशनी समूह। बनाएं ए लक्ष्य 2 चैनल (वीआईसी), चुनना  रिपोर्टिंग रोशनी समूह जैसा विक और  शमन रोशनी समूह जैसा कोई नहीं। में "सौंपना लक्ष्यों को और नमूने" का "थाली स्थापित करना", अगर नहीं अतिरिक्त रॉक्स डाई है जोड़ा गया, चुनें "कोई नहीं"; यदि कोई अतिरिक्त रॉक्स है जोड़ा गया, चुनें

रॉक्स.

1. मानक प्रवर्धन कार्यक्रम सेटिंग्स

तालिका 5 मानक प्रवर्धन कार्यक्रम सेटिंग्स

1. आधार रेखा और सीमा निर्धारण:

सिद्धांत का आधारभूत समायोजन: उपयोग  स्वचालित आधारभूत आम तौर पर। अगर ज़रूरत को समायोजित करना में नियमावली, चुनना  चक्र घातीय वृद्धि से पहले अवधि को चक्र की शुरुआत के रूप में लें और उतार-चढ़ाव वाले क्षेत्र से बचें प्रारंभिक रोशनी संग्रह। वह चक्र चुनें जो सबसे पहले घातीय प्रवर्धन नमूने के सीटी से 1-2 चक्र पहले है।

अंतिम बिंदु.

सिद्धांत का सीमा समायोजन: आम तौर पर स्वचालित सीमा का उपयोग करें। यदि मैन्युअल में समायोजन की आवश्यकता है, तो सीमा चाहिए होना तय करना उच्च बजाय  नकारात्मक नमूना या  आधारभूत शोर, इसका आम तौर पर तय करना दहलीज में  देर

का चरण प्रत्येक सुरंग के लिए घातीय प्रवर्धन, सापेक्ष स्वतंत्र और उपयुक्त सीमा की आवश्यकता होती है।

5） परिणाम विश्लेषण

1. पीसीएस, एनटीसी और एनसीएस के लिए परिणाम निर्णय:

यदि आईसी जोड़ा गया: प्रत्येक नियंत्रण नमूने का विनिर्देश होना चाहिए तालिका 6 में संतुष्ट:

मेज़ 6 परिणाम प्रलय का पीसीएस, एनटीसी और एनसीएस

यदि IC नहीं जोड़ा गया है: प्रत्येक गुणवत्ता नियंत्रण नमूना तालिका 6 में FAM संकेत कॉलम के विनिर्देश को पूरा करेगा, और कोई भी IC नहीं जोड़ा जाएगा।

विश्लेषण करने की आवश्यकता है वीआईसी चैनल.

1. टीएस के लिए परिणाम निर्णय

पूर्वापेक्षा: यह है यह निर्धारित करना आवश्यक है कि पीसीएस, एनटीसी और एनसीएस विनिर्देश पारित तालिका में 6 टीएस से पहले परिणाम विश्लेषण. यदि पारित हो गया, तो आगे बढें अगला कदम. यदि नहीं उत्तीर्ण,  टी परिणाम मई नहीं होना भरोसेमंद, और

इसके कारण की जांच की जानी चाहिए।

यदि IC जोड़ा गया: संगत परिणाम ज्ञात करें एफएएम की परिणाम जानकारी के अनुसार निर्णय और विक तालिका 7 में:

मेज़ 7: परिणाम प्रलय का टी (मैं सी जोड़ा गया)

*अगर वहाँ है निषेध के लिए विक संकेत,उपचार है आवश्यकता है को हटाना  अवरोधकों या दोहराना  परीक्षा।

यदि IC नहीं जोड़ा गया है: संगत परिणाम ज्ञात करें के अनुसार निर्णय तालिका 8 में FAM की परिणाम जानकारी , और इसका विश्लेषण करने की कोई आवश्यकता नहीं है वीआईसी संकेत.

मेज़ 8: परिणाम प्रलय का टी (मैं सी नहीं जोड़ा गया)

नोट्स

1. कृपया इस किट का उपयोग करने से पहले इस मैनुअल को ध्यान से पढ़ें। प्रयोग को मानकीकृत तरीके से किया जाना चाहिए, जिसमें नमूना संभालना, प्रतिक्रिया प्रणाली की तैयारी और नमूना जोड़ना शामिल है।

2. यदि संभव हो तो नमूना जोड़ने और अभिकर्मकों की तैयारी का कार्य बर्फ पर ही रखें।
3. उपयोग से पहले प्रत्येक अभिकर्मक को अच्छी तरह से मिलाएं।

4. कृपया लैब कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने के साथ काम करें, आपकी सुरक्षा.
5. यह प्रॉडक्ट केवल शोध के उपयोग के लिए है।