विवरण
रैखिककृत पॉलीइथिलीनमाइन PEI 25000 ट्रांसफ़ेक्शन अभिकर्मक एक अत्यधिक आवेशित धनायनिक बहुलक है जो आसानी से ऋणात्मक रूप से आवेशित न्यूक्लिक एसिड अणुओं को बांधता है, एक जटिल बनाता है, और जटिल को कोशिका में प्रवेश करने देता है। ट्रांसफ़ेक्शन अभिकर्मक एक क्षणिक ट्रांसफ़ेक्शन अभिकर्मक है जिसमें कम साइटोटॉक्सिसिटी, उच्च ट्रांसफ़ेक्शन दक्षता और HEK293 और CHO जैसी कोशिकाओं में उच्च जीन अभिव्यक्ति दक्षता है। यह सत्यापित किया गया है कि रैखिक PEI ट्रांसफ़ेक्शन अभिकर्मक HEK-293, HEK293T, CHO-K1, COS-1, COS-7, NIH/3T3, Sf9, HepG2 और हेला कोशिकाओं आदि सहित विभिन्न प्रकार की सेल लाइनों पर व्यापक रूप से लागू होता है। अभिकर्मक सीरम युक्त मीडिया के साथ संगत है और कोशिकाओं में न्यूक्लिक एसिड को कुशलतापूर्वक पेश कर सकता है।
विनिर्देश
| नाम | पॉलीइथिलीनिमाइन रैखिक (पीईआई) एमW25000 |
| CAS संख्या। | 9002-98-6, 26913-06-4 |
| आणविक सूत्र | (सीएच2चौधरी2एनएच)एन |
| आणविक वजन | 25,000 |
| उपस्थिति | सफ़ेद या हल्का पीला पाउडर |
| गलनांक | 73~75 ℃ |
| घुलनशीलता | गर्म पानी, कम pH वाले ठंडे पानी, मेथनॉल और इथेनॉल में घुलनशील। बेंजीन, ईथर और एसीटोन में अघुलनशील |
| संरचना |
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शिपिंग और भंडारण
उत्पाद को कमरे के तापमान पर भेजा जाता है और पाउडर को दो साल तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। स्टॉक समाधान को 3 महीने के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है।
चेतावनी
1) तैयार PEI घोल को -20 ºC से बाहर निकालने और पिघलाने के बाद, इसे 4 ºC रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत किया जा सकता है और इसे दोबारा जमाना नहीं चाहिए।
2) अधिकांश कोशिकाओं के लिए, 1 μg DNA में 3.0 μL PEI ट्रांसफ़ेक्शन अभिकर्मक उच्च ट्रांसफ़ेक्शन दक्षता प्राप्त कर सकता है। आप अनुकूलन के लिए 1 μg DNA में रैखिक PEI ट्रांसफ़ेक्शन अभिकर्मक की 1.5~4 μL मात्रा का उपयोग करने का भी प्रयास कर सकते हैं।
3) अपनी सुरक्षा और स्वास्थ्य के लिए, कृपया काम करते समय लैब कोट, डिस्पोजेबल दस्ताने और फ्यूम हुड पहनें।
4) यह उत्पाद केवल वैज्ञानिक अनुसंधान प्रयोजनों के लिए है, मानव उपयोग के लिए नहीं।
स्टॉक समाधान तैयारी (1 मिलीग्राम/एमएल)
1. सामग्री
PEI 25000, Milli-Q® जल/इंजेक्शन के लिए जल (WFI) या समान जैविक ग्रेड जल, 12 mol/L हाइड्रोक्लोरिक अम्ल (HCl), 10 mol/L सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH), डिस्पोजेबल 0.1~0.2 μm PES वैक्यूम स्टेराइल फिल्टर, स्टेराइल HDPE या पॉलीप्रोपाइलीन भंडारण बोतल।
2. स्टॉक समाधान तैयार करें (1 मिलीग्राम/एमएल)
1) 1 लीटर के ग्लास बीकर में, 1 ग्राम PEI 25000 पाउडर को 900 मिली.ली. मिलि-क्यू® अल्ट्राप्योर जल या अन्य समतुल्य जैविक जल में मिलाएं, तथा एक छोटे भंवर का निर्माण करने के लिए चुंबकीय स्टिरर पर समान रूप से हिलाएं।
2) हाइड्रोक्लोरिक एसिड (12 मोल/एल) को बूंद-बूंद करके डालें और pH को तब तक समायोजित करते रहें जब तक pH <2.0 न हो जाए।
3) बीकर के ऊपरी हिस्से को ढक दें और पूरी तरह घुलने तक 3 घंटे तक हिलाते रहें; पूरी प्रक्रिया के दौरान pH < 2.0 रखें।
【नोट】: कुछ छोटे रेशेदार कण हो सकते हैं जिन्हें भंग नहीं किया जा सकता है, जो एक सामान्य घटना है।
4) pH को 6.9 ~ 7.1 तक पहुंचने तक समायोजित करने के लिए हिलाते हुए NaOH (10 mol/L) बूंद-बूंद करके डालें।
5) घोल को एक अंशांकित सिलेंडर में डालें, और 1 लीटर तक पानी मिलाएं।
6) 1 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए डिस्पोजेबल 0.1-0.2 µm PES वैक्यूम फिल्टर से फ़िल्टर और स्टेरलाइज़ करें।
7) आवश्यकतानुसार विभाजित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 वर्ष तक स्थिर रखें।
【नोट】: भंडारण समाधान को फिर से पिघलाने के बाद, इसे 4 °C पर संग्रहीत किया जा सकता है और यह 2 सप्ताह तक स्थिर रहता है, लेकिन इसे फिर से जमाया नहीं जाना चाहिए
ट्रांसफ़ेक्शन प्रक्रिया (उदाहरण के तौर पर 6-वेल प्लेट लेना)
1. कोशिका टीकाकरण: अभिकर्मक दक्षता में सुधार करने के लिए, अभिकर्मक से एक दिन पहले कोशिकाओं को टीका लगाने की सिफारिश की जाती है, और अभिकर्मक के समय कोशिका घनत्व अधिमानतः 70% ~ 80% है।
2. डीएनए-पीईआई कॉम्प्लेक्स तैयार करें: निम्नलिखित प्रणाली के अनुसार डीएनए-पीईआई न्यूक्लिक एसिड-ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक कॉम्प्लेक्स तैयार करें:
1) कोशिकाओं के प्रत्येक वेल के लिए, लक्ष्य डीएनए के 2 μg को 100 μL सीरम-मुक्त माध्यम के साथ पतला करें, और डीएनए कमजोरीकरण बनाने के लिए अच्छी तरह मिलाएं।
[नोट]: सीरम-मुक्त मंदक के लिए ऑप्टि-एमईएम या ddH2O की सिफारिश की जाती है
2) तुरंत 100 μL डीएनए तनुकारक में 5 μL PEI 25000 अभिकर्मक मिलाएं, 10 सेकंड के लिए घुमाएं, और अच्छी तरह मिलाएं।
3) डीएनए-पीईआई कैटायनिक न्यूक्लिक एसिड ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए कमरे के तापमान पर 10-25 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
3. ट्रांसफ़ेक्टेड कोशिकाएँ:
1) जटिल निर्माण के दौरान, कोशिका वृद्धि माध्यम को हटा दें और प्रत्येक वेल में 2 एमएल ताजा पूर्व-गर्म पूर्ण माध्यम डालें।
2) 100 μL डीएनए-पीईआई न्यूक्लिक एसिड-पीईआई कॉम्प्लेक्स को सीधे कोशिकाओं में जोड़ें, कल्चर प्लेट को हिलाएं, और धीरे से मिलाएं।
3) 37°C, 5% CO2 इनक्यूबेटर में खेती करें, और ट्रांसफ़ेक्शन के 7 घंटे बाद ही ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति का पता लगाया जा सकता है। कृपया उपयुक्त परीक्षण समय स्वयं निर्धारित करें।
4. स्थिर रोटेशन स्क्रीनिंग (वैकल्पिक)
ट्रांसफ़ेक्शन के 24 घंटे बाद, कोशिकाओं को ताज़ा ग्रोथ मीडियम में उपसंस्कृत किया गया (कोशिकाओं को 10 से ज़्यादा बार पतला किया गया), और 5% CO2 इनक्यूबेटर में 37 °C पर रात भर इनक्यूबेट किया गया। अगले दिन, ट्रांसफ़ेक्शन प्रतिरोध जीन से मेल खाने वाली एक स्क्रीनिंग दवा डाली गई। दवा प्रतिरोधी क्लोनों की स्क्रीनिंग लगभग 1 से 2 सप्ताह में की जा सकती है। इस अवधि के दौरान, स्क्रीनिंग दवाओं वाले ग्रोथ मीडियम को बार-बार बदलने की ज़रूरत होती है।
विभिन्न कोशिका संवर्धन वाहिकाओं के लिए अभिकर्मक खुराक (केवल संदर्भ के लिए):
| संस्कृति जहाज़ | सर्फ. क्षेत्र प्रति कुआं*(सेमी2) | डीएनए(μg) | अभिकर्मक अभिकर्मक(μL) | खंड. का पतला करने की क्रिया मध्यम **(μएल) | खंड. का चढ़ाना मध्यम |
| 96 अच्छी तरह से | 0.3 | 0.1 | 0.1 | 10 | 100μएल |
| 48-अच्छी तरह से | 0.7 | 0.2 | 0.3 | 20 | 200μएल |
| 24-अच्छी तरह से | 1.9 | 0.5 | 1 | 50 | 500μएल |
| 12-अच्छी तरह से | 3.8 | 1 | 2 | 50 | 1एमएल |
| 6-अच्छी तरह से | 10 | 2 | 4 | 100 | 2एमएल |
| फ्लास्क 25सेमी² | 21 | 4 | 8 | 200 | 4 एमएल |
| फ्लास्क 75सेमी² | 58 | 10 | 20 | 500 | 10 एमएल |
उद्धरण एवं संदर्भ:
[1] किन जे, कै वाई, जू जेड, एट अल. घ्रेलिन रिसेप्टर में एगोनिज्म और इनवर्स एगोनिज्म का आणविक तंत्र। नैट कम्यूनिटी। 2022;13(1):300. 2022 जनवरी 13 को प्रकाशित। doi:10.1038/s41467-022-27975-9(आईएफ:14.919)
[2] वांग वाई, चेन जे, गाओ डब्ल्यूक्यू, यांग आर. METTL14 m6A-YTHDF2-निर्भर तंत्र के माध्यम से THBS1 को बाधित करके प्रोस्टेट ट्यूमरजनन को बढ़ावा देता है। सेल डेथ डिस्कोव. 2022;8(1):143. प्रकाशित 2022 मार्च 30. doi:10.1038/s41420-022-00939-0(आईएफ:5.241)
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