ई कोलाई मेजबान कोशिका डीएनए अवशेष जांच किट का उपयोग ई.कोली के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया जाता है विभिन्न जैविक उत्पादों के मध्यवर्ती नमूनों, अर्द्ध-तैयार और तैयार उत्पादों में मेजबान कोशिका डीएनए अवशेष।

यह किट टैकमैन फ्लोरोसेंट जांच और पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) विधि को अपनाती है, जिसमें एफजी स्तर की न्यूनतम पहचान सीमा होती है और यह विशेष रूप से और जल्दी से अवशिष्ट ई.कोली का पता लगा सकती है सेल डीएनए। किट को अवशिष्ट डीएनए नमूना तैयारी किट (कैट # 18461ES) के साथ उपयोग करने की आवश्यकता है।

सत्यापन रिपोर्ट

विशेष विवरण

अवयव

भंडारण

इस उत्पाद को 2 वर्षों तक -25~-15℃ तापमान पर संग्रहित किया जाना चाहिए।

41308-A और 41308-B दोनों को प्रकाश से सुरक्षित रखकर संग्रहित किया जाना चाहिए।

लागू उपकरण मॉडल

इसमें शामिल हैं लेकिन इन्हीं तक सीमित नहीं:

बायो-रेड: सीएफएक्स96 ऑप्टिक मॉड्यूल.

थर्मो साइंटिफिक: एबीआई 7500; एबीआई क्वांट स्टूडियो 5.

निर्देश

1. ई कोलाई। डीएनए मानक कमजोरीकरण और मानक वक्र तैयारी

ई.कोली किट में दिए गए डीएनए डाइल्यूशन बफर का उपयोग करके डीएनए कंट्रोल को ग्रेडिएंट रूप से पतला किया गया^*, और कमजोर पड़ना

सांद्रता 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL है।

नीचे विस्तृत निर्देश देखें:

• कोलीडीएनए नियंत्रण और डीएनए कमजोरीकरण बफर को बर्फ पर पिघलाएं। पूरी तरह से पिघलने के बाद, मिश्रण करने के लिए धीरे से भंवर करें, और 10 सेकंड के लिए कम गति पर सेंट्रीफ्यूज करें।
• छः साफ 1.5 एमएल ट्यूब निकालें, जिन पर Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5 अंकित हों।
• 90 μL डीएनए कमजोर पड़ने वाले बफर और 10 μL कोलीडीएनए नियंत्रण को 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में जोड़ें, जिसे Std0 लेबल किया गया है, अर्थात 3 ng/μL तक पतला करें। मिक्स करें और फिर 10 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। पतला डीएनए मानक को सबपैकेज करें और इसे अल्पावधि (3 महीने से अधिक नहीं) में -25~-15℃ पर संग्रहीत किया जा सकता है^**कृपया बार-बार फ्रीज-थॉ से बचें।
• अन्य ट्यूबों में 90 μL डीएनए कमजोरीकरण बफर जोड़ें^***, फिर क्रमिक कमजोरीकरण के लिए नीचे दी गई प्रक्रिया का पालन करें^****.

तालिका1 मानक ढाल कमजोरीकरण

^*प्रत्येक सांद्रता के लिए तीन प्रतिकृति कुओं की आवश्यकता होती है। पता लगाने की सीमा 30 है fg/μL~300pg/μL और इस सीमा को बढ़ाया जा सकता है।

^**बार-बार होने वाले हिमीकरण-विगलन की संख्या को कम करने और संदूषण से बचने के लिए, पहली बार डीएनए नियंत्रण को -25 ~ -15 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित करने की सिफारिश की जाती है।

^***एक बार पिघलने के बाद, डीएनए कमजोर पड़ने वाले बफर को 7 दिनों के लिए 2-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, यदि लंबे समय तक उपयोग नहीं किया जाता है, तो कृपया -25 ~ -15 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

^****सुनिश्चित करें कि टेम्पलेट पूरी तरह से मिश्रित हो गया है, प्रत्येक ग्रेडिएंट कमजोरीकरण के लिए मिश्रण को 15 सेकंड से 1 मिनट तक धीरे से हिलाएं।

2. निष्कर्षण पुनर्प्राप्ति नियंत्रण (ERC) तैयारी

ई.आर.सी. में ई.कोली डी.एन.ए. की सांद्रता आवश्यकतानुसार निर्धारित करें (उदाहरण के लिए ई.आर.सी. नमूना 30 पी.जी. ई.कोली डी.एन.ए. के साथ तैयार किया गया था), इस प्रकार:

• एक साफ 1.5 एमएल ट्यूब में 100 μL परीक्षण नमूना डालें, फिर 10 μL 3pg/μL ई.कोली डीएनए मानक (Std3) डालें और अच्छी तरह मिलाएं, जिसे ERC के रूप में चिह्नित किया गया है।
• शुद्ध ई.आर.सी. नमूना तैयार करने के लिए परीक्षण नमूनों के साथ ई.आर.सी. नमूने का डीएनए निष्कर्षण करें।

3. नकारात्मक नियंत्रण समाधान (एनसीएस) की तैयारी

प्रयोग में नकारात्मक नियंत्रण सेट करें, विशिष्ट संचालन चरण निम्नानुसार हैं:

1) 100 μL नमूना मैट्रिक्स (या डीएनए कमजोर पड़ने बफर) को एक साफ 1.5 एमएल ट्यूब में डालें, फिर एनसीएस के रूप में चिह्नित करें।

2) शुद्ध एनसीएस नमूना तैयार करने के लिए परीक्षण नमूनों के साथ एनसीएस नमूने का डीएनए निष्कर्षण करें।

4. कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) तैयारी नहीं

प्रयोग में कोई टेम्पलेट नियंत्रण सेट करें, विशिष्ट संचालन चरण निम्नानुसार हैं:

1) एनटीसी को नमूने के पूर्व उपचार की आवश्यकता नहीं होती है, तथा इसे अवशिष्ट डीएनए के qPCR पता लगाने के चरण में कॉन्फ़िगर किया जा सकता है।

2) प्रत्येक ट्यूब या वेल में NTC नमूना 20 μL मिक्स (यानी 15 μL E.coli qPCR मिक्स + 5 μL E.coli प्राइमर और जांच मिक्स) + 10 μL DNA कमजोर पड़ने वाला बफर है। तीन प्रतिकृति कुओं को कॉन्फ़िगर करने की सिफारिश की जाती है।

5. पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली

तालिका2 प्रतिक्रिया प्रणाली

^*प्रतिक्रियाओं की संख्या से कुल PCR प्रतिक्रिया मात्रा की गणना करें: qPCR मिश्रण = (प्रतिक्रियाओं की संख्या + 2) × (15+5) μL (दो प्रतिक्रिया कुओं के नुकसान सहित)। प्रयोग में प्रत्येक नमूने के लिए तीन से अधिक प्रतिकृतियों की सिफारिश की जाती है।

^**ट्यूब को ढकने या प्लेट को सील करने के बाद, रिएक्शन ट्यूब या प्लेट को 10 सेकंड के लिए कम गति पर सेंट्रीफ्यूज करें। 5 सेकंड के लिए पर्याप्त हिलाने और मिश्रण करने के बाद, ढक्कन या दीवार से नीचे तक तरल इकट्ठा करने के लिए सेंट्रीफ्यूज को दोहराएं। ऑपरेशन के दौरान बुलबुले से बचें।

अनुशंसित प्लेट सेटअप के लिए नीचे दी गई तालिका देखें:

तालिका3 कंप्यूटर पर संदर्भ बोर्ड

प्लेट लेआउट में शामिल हैं: 5 स्टैंडर्ड (5 मानक सांद्रता का मानक वक्र), 1 एनटीसी (कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं), 1 एनसीएस (नकारात्मक नियंत्रण समाधान), 3 टीएस (परीक्षण नमूने), 3 ईआरसी (निष्कर्षण पुनर्प्राप्ति नियंत्रण)।प्रत्येक नमूने के लिए तीन प्रतिकृति कुएँ।

6. स्थापित करना पीसीआर उपकरण के लिए दिशानिर्देश(2-चरण विधि) (उदाहरणार्थ थर्मो एबीआई 7500 क्यूपीसीआर उपकरण, संस्करण 2.0 सॉफ्टवेयर)

निम्नलिखित निर्देश केवल थर्मो एबीआई 7500 क्यूपीसीआर उपकरण (सॉफ्टवेयर संस्करण 2.0) पर लागू होते हैं। यदि आप किसी भिन्न उपकरण का उपयोग करते हैं, तो सेटअप दिशा-निर्देशों के लिए लागू उपकरण गाइड देखें।

1) एक नया प्रयोग तैयार करें, पूर्ण परिमाणीकरण या उपयोगकर्ता-परिभाषित टेम्पलेट चुनें।

2) 1 डिटेक्शन जांच बनाएं, जिसका नाम "ई.कोली-डीएनए" हो, रिपोर्टर फ्लोरोफोर को "FAM" के रूप में चुनें और क्वेंच फ्लोरोफोर को "कोई नहीं" के रूप में चुनें। संदर्भ प्रतिदीप्ति ROX है" (संदर्भ प्रतिदीप्ति उपकरण मॉडल आदि पर आधारित हो सकती है, चुनें कि आपको इसे जोड़ने की आवश्यकता है या नहीं)।

3) 'नमूने' पैन में, सभी नमूनों की जानकारी बारी-बारी से जोड़ें। फिर कुओं का चयन करें, लक्ष्य और नमूने को तदनुसार चुनें। E.coli का कार्य निर्धारित करें डीएनए मानक को मानक के रूप में रखें, और मात्रा कॉलम में मान 300000, 30000, 3000, 300, 30 (प्रत्येक वेल में डीएनए सांद्रता की इकाई fg/μL है) निर्दिष्ट करें, और वेल्स को नाम दें Std 1, मानक 2, मानक 3, स्टैंडर्ड 4, स्टैंडर्ड 5, तदनुसार। NTC का कार्य NTC के रूप में सेट करें। NCS, TS, और ERC सेट करें अज्ञात के रूप में, और उन्हें उपरोक्त प्लेट लेआउट के अनुसार नाम दें। फिर अगला क्लिक करें।

4) प्रवर्धन कार्यक्रम सेट करें: प्रतिक्रिया मात्रा 30 μL पर सेट करें।

तालिका4 प्रवर्धन प्रक्रिया

7. क्यूपीसीआर परिणामों का विश्लेषण

1) सिस्टम स्वचालित रूप से विश्लेषण के एम्पलीफिकेशन प्लॉट पैनल में थ्रेशोल्ड देगा। सिस्टम द्वारा दिया गया थ्रेशोल्ड कभी-कभी बेसलाइन के बहुत करीब होता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिकृति कुओं के बीच सीटी में बड़ा अंतर होता है। आप थ्रेशोल्ड को मैन्युअल रूप से उचित स्थिति में समायोजित कर सकते हैं और विश्लेषण पर क्लिक कर सकते हैं। फिर आप शुरू में जाँच कर सकते हैं कि मल्टीकंपोनेंट प्लॉट में एम्पलीफिकेशन कर्व सामान्य है या नहीं।

2) परिणाम विश्लेषण टैब में, मानक वक्र प्लॉट की समीक्षा करें। R के मानों की पुष्टि करें², दक्षता, ढलान और Y-अवरोधन। एक सामान्य मानक वक्र के लिए, R²>0.99, 90%≤Eff%≤110%, -3.6≤Slope≤-3.1.

3) विश्लेषण में 'व्यू वेल टेबल' फलक में, प्रत्येक नमूने की सांद्रता मात्रा में दिखाई जाती है, इकाई fg/μL है, इकाइयों को परख रिपोर्ट में परिवर्तित किया जा सकता है।

4) परिणाम विश्लेषण के पैरामीटर सेटिंग्स को विशिष्ट मॉडल और उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर संस्करण पर आधारित होना चाहिए, और आमतौर पर उपकरण द्वारा स्वचालित रूप से व्याख्या की जा सकती है।

5) मापे जाने वाले नमूने टीएस के परीक्षण परिणामों और नमूना स्पाइक रिकवरी ईआरसी के आधार पर स्पाइक रिकवरी दर की गणना करें, स्पाइक्स की रिकवरी दर 50% ~ 150% के बीच होनी आवश्यक है।स्पाइक्ड रिकवरी दर मीटर सूत्र: रिकवरी (%) = {Sample spiked assay (eg.pg/μL) - Sample assay (eg.pg/μL)} x निक्षालन आयतन (μL) / DNA योग मात्रा का सैद्धांतिक मान (उदाहरणार्थ pg) x 100%।

6) नकारात्मक नियंत्रण एनसीएस का सीटी मान मानक के न्यूनतम सांद्रता सीटी के माध्य से अधिक होना चाहिए।

• टेम्पलेट मुक्त नियंत्रण एनटीसी अनिर्धारित या सीटी मान ≥3 होना चाहिए

नोट्स

1. यह प्रॉडक्ट केवल शोध के उपयोग के लिए है।
2. कृपया अपनी सुरक्षा के लिए लैब कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनकर काम करें।

3. कृपया इस अभिकर्मक का उपयोग करने से पहले इस मैनुअल को ध्यान से पढ़ें, और प्रयोग मानकीकृत होना चाहिए, जिसमें नमूना हैंडलिंग, प्रतिक्रिया प्रणाली की तैयारी और नमूना जोड़ना शामिल है।

4.सुनिश्चित करें कि उपयोग से पहले प्रत्येक घटक पूरी तरह से भंवरीकृत और कम गति पर अपकेंद्रित्रित हो।

नियमावली