प्रतिकृति-सक्षम लेन्टिवायरस (RCL) डिटेक्शन किट का उपयोग किया जाता है मात्रात्मक रूप से प्रतिकृति बनाने वाले लेंटिवायरस का पता लगाना में हो सकता है लेंटिवायरल से जुड़े विभिन्न प्रकार के कोशिका उत्पाद वेक्टर संभावित जोखिम.

यह किट विशिष्ट प्राइमरों को डिजाइन करती है लेंटिवायरल लिफाफा प्रोटीन का वीएसवी-जी जीन अनुक्रम। और यह तक़मान को अपनाता है  फ्लोरोसेंट जांच और पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) विधि, जिसमें 1 प्रतियां/μL स्तर का पता लगाने की सीमा होती है और विशेष रूप से और शीघ्रता से पता लगा सकते हैं प्रतिकृति-सक्षम लेन्टिवायरस जोखिम। किट की जरूरत है साथ में उपयोग किया जाना अवशिष्ट डीएनए नमूना तैयारी किट (कैट # 18461ES)।

अवयव

* मैं सी: आंतरिक नियंत्रण।

भंडारण

इस उत्पाद को -25~-15℃ तापमान पर संग्रहित किया जाना चाहिए 2 के लिए साल।

41311-ए और 41311-बी दोनों को प्रकाश से सुरक्षित रखकर संग्रहित किया जाना चाहिए।

उपयुक्त यंत्र मॉडल

इसमें शामिल हैं लेकिन इन्हीं तक सीमित नहीं: बायो-रेड: सीएफएक्स96 ऑप्टिक मॉड्यूल; थर्मो साइंटिफिक: एबीआई 7500; एबीआई क्वांट स्टूडियो 5; अबी स्टेप वनप्लस.

निर्देश

1. आरसीएल डीएनए मानक पतला करने की क्रिया और मानक वक्र तैयारी

आरसीएल डीएनए नियंत्रण को किट में दिए गए डीएनए कमजोरीकरण बफर का उपयोग करके ढाल पतला किया गया था* , और कमजोर पड़ना सांद्रता 5×10E7 है प्रतियाँ/μL, 5×10E6 प्रतियाँ/μL, 5×10E5 प्रतियाँ/μL, 5×10E4 प्रतियाँ/μL, 5×10E3 प्रतियाँ/μL, 5×10E2 प्रतियां/μL, 5×10ई1 प्रतियां/μL.

नीचे विस्तृत निर्देश देखें:

1) आरसीएल डीएनए नियंत्रण और डीएनए कमजोरीकरण बफर को बर्फ पर पिघलाएं। पूरी तरह से पिघलने के बाद, भंवर धीरे से मिश्रण, और 10 सेकंड के लिए कम गति पर अपकेंद्रित्र।

2) Std0, Std1, Std2, Std3, Std4, Std5, Std6 से चिह्नित सात साफ 1.5 एमएल ट्यूब निकालें।

3) 90 जोड़ें μL डीएनए कमजोरीकरण बफर और 10 μL RCL DNA नियंत्रण को 1.5 mL माइक्रोफ्यूज ट्यूब में Std0 लेबल किया गया, अर्थात्   5×10E7 तक पतला करें प्रतियाँ/μL. मिश्रण और फिर 10 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। पतला डीएनए मानक उप-पैकेज और यह हो सकता है अल्पावधि में (3 महीने से अधिक नहीं) -25~-15℃** पर संग्रहित किया गया कृपया बार-बार फ्रीज-थॉ से बचें।

4) 90 जोड़ें अन्य ट्यूबों में डीएनए कमजोरीकरण बफर की μL*** , तो नीचे दी गई प्रक्रिया का पालन करें धारावाहिक कमजोरीकरण**** .

तालिका1 मानक ढाल कमजोरीकरण

*तीन दोहराने कुओं हैं आवश्यक के लिए प्रत्येक एकाग्रता. का पता लगाने श्रेणी है 5×10ई1 प्रतियाँ/μL~5×10E6 प्रतियाँ/μL और यह श्रेणी कर सकना होना यदि आवश्यक हो तो विस्तारित किया जा सकता है।

** को कम करना  संख्या का दोहराना फ्रीज पिघलाव और टालना संदूषण, यह है अनुशंसित को इकट्ठा करना  डीएनए नियंत्रण में विभाज्य पर -25~-15℃ के लिए  पहला समय।

*** एक बार पिघला हुआ, डीएनए पतला करने की क्रिया बफर सकना होना संग्रहित पर 2-8° सेल्सियस के लिए 7 दिन, यदि नहीं इस्तेमाल किया गया के लिए ए लंबा समय, कृपया इकट्ठा करना पर -25~-15℃ .

**** बनाना ज़रूर  खाका है पूरी तरह मिश्रित, धीरे से हिलाना  मिश्रण के लिए 15 सेकंड को 1 मिनट के लिए प्रत्येक ग्रेडियेंट कमजोरीकरण.

2. निष्कर्षण पुनर्प्राप्ति नियंत्रण (ईआरसी) तैयारी

ईआरसी में आरसीएल डीएनए की सांद्रता को आवश्यकतानुसार सेट करें (ईआरसी नमूना 5×10E4 के साथ तैयार किया गया था आरसीएल डीएनए की प्रतिलिपि बनाता है एक उदाहरण), इस प्रकार:

1) 100 जोड़ें μL परीक्षण नमूना एक साफ 1.5 mL ट्यूब में डालें, फिर 10 जोड़ें μएल 5×10E3 प्रतियां/μL आरसीएल डीएनए मानक (Std4) और अच्छी तरह मिलाएं, ईआरसी के रूप में चिह्नित।

2) शुद्ध ई.आर.सी. नमूना तैयार करने के लिए परीक्षण नमूनों के साथ ई.आर.सी. नमूने का डीएनए निष्कर्षण करें।

3. नकारात्मक नियंत्रण समाधान (एनसीएस) तैयारी

प्रयोग में नकारात्मक नियंत्रण सेट करें, विशिष्ट संचालन चरण निम्नानुसार हैं:

1) 100 जोड़ें μL नमूना मैट्रिक्स (या डीएनए कमजोर पड़ने वाला बफर) एक साफ 1.5 एमएल ट्यूब में, फिर चिह्नित किया गया एनसीएस.

2) एनसीएस का डीएनए निष्कर्षण करें शुद्ध एनसीएस तैयार करने के लिए परीक्षण नमूनों के साथ नमूना नमूना।

4. कोई टेम्पलेट नहीं नियंत्रण (एनटीसी) तैयारी

प्रयोग में कोई टेम्पलेट नियंत्रण सेट करें, विशिष्ट संचालन चरण निम्नानुसार हैं:

1) एनटीसी को किसी नमूने के पूर्व उपचार की आवश्यकता नहीं होती है, और इसे अवशिष्ट डीएनए के qPCR पता लगाने के चरण में कॉन्फ़िगर किया जा सकता है सामग्री।

2) प्रत्येक ट्यूब या कुँए में एनटीसी नमूना 20 है μL मिक्स (अर्थात 15 μL आरसीएल qPCR मिक्स + 4 μएल आरसीएल प्राइमर&जांच मिक्स + 1 μएल आईसी) + 10 μL डीएनए कमजोर पड़ने बफर। यह तीन प्रतिकृति कुओं को कॉन्फ़िगर करने के लिए अनुशंसित है।

5. पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली

तालिका2 प्रतिक्रिया प्रणाली

* गणना  कुल पीसीआर प्रतिक्रिया आयतन द्वारा  संख्या का प्रतिक्रियाएँ: qPCR मिक्स =(द संख्या का प्रतिक्रियाएं+2) × (15+4+1) μL (सहित  का नुकसान प्रयोग में प्रत्येक नमूने के लिए तीन से अधिक प्रतिकृतियों की सिफारिश की जाती है।

** बाद कैपिंग  नली या मुद्रण  प्लेट, अपकेंद्रित्र  प्रतिक्रिया नली या थाली पर कम रफ़्तार के लिए 10 सेकंड बाद पर्याप्त हिलना और मिश्रण के लिए 5 सेकंड, दोहराएँ अपकेंद्रित्र को इकट्ठा करना  तरल से  ढक्कन या दीवार को  नीचे. से बचें बबल दौरान संचालन।

अनुशंसित प्लेट सेटअप के लिए नीचे दी गई तालिका देखें:

तालिका3 कंप्यूटर पर संदर्भ तख़्ता

प्लेट लेआउट में शामिल हैं: 6 स्टैंडर्ड (6 मानक सांद्रता का मानक वक्र), 1 एनटीसी (कोई टेम्पलेट नियंत्रण नहीं), 1 एनसीएस (नकारात्मक नियंत्रण समाधान), 3 टीएस (परीक्षण नमूने), 3 ईआरसी (निष्कर्षण पुनर्प्राप्ति नियंत्रण)।तीन प्रतिकृति कुओं के लिए प्रत्येक नमूना.

6. सेटअप दिशानिर्देश के लिए ए पीसीआर यंत्र

निम्नलिखित निर्देश केवल निम्नलिखित पर लागू होते हैं: थर्मामीटरों एबीआई 7500 qPCR उपकरण (सॉफ्टवेयर संस्करण 2.0). यदि आप एक का उपयोग करें अलग उपकरण के लिए, सेटअप दिशानिर्देशों के लिए लागू उपकरण गाइड देखें।

1) एक नया प्रयोग तैयार करें, पूर्ण परिमाणीकरण का टेम्पलेट चुनें या उपयोगकर्ता परिभाषित।

2) 1 डिटेक्शन जांच बनाएं, जिसका नाम "RCL-DNA" हो, रिपोर्टर फ्लोरोफोर को "FAM" के रूप में चुनें और क्वेंच फ्लोरोफोर को चुनें "कोई नहीं"; 1 और डिटेक्शन जांच बनाएं, नाम "IC" रखें और रिपोर्टर फ्लोरोफोर को "CY5" के रूप में चुनें और शमन करें फ्लोरोफोर को "कोई नहीं" के रूप में। संदर्भ प्रतिदीप्ति ROX है" (संदर्भ प्रतिदीप्ति पर आधारित हो सकता है) उपकरण मॉडल, आदि का चयन करें चाहे आपको इसे जोड़ना होगा)।

3) में 'नमूने' फलक में, सभी नमूनों की जानकारी बारी-बारी से जोड़ें। फिर कुओं का चयन करें, लक्ष्य चुनें और नमूने तदनुसार सेट करें। आरसीएल डीएनए मानक के रूप में कार्य को मानक बनाना, और असाइन करना मान 5000000, 500000, मात्रा कॉलम में 50000, 5000, 500, 50 (प्रत्येक वेल में डीएनए सांद्रता की इकाई प्रतियां/μL है) और नाम दें  कुओं Std 1, Std 2, Std 3, Std 4, Std 5, Std 6, तदनुसार। सेट करें एनटीसी का कार्य एनटीसी के रूप में करें। एनसीएस, टीएस और ईआरसी को इस प्रकार सेट करें अज्ञात, और उन्हें उपरोक्त प्लेट लेआउट के अनुसार नामित किया गया। फिर अगला क्लिक करें.

4) प्रवर्धन कार्यक्रम सेट करें: प्रतिक्रिया मात्रा 30 μL पर सेट करें।

तालिका4 प्रवर्धन प्रक्रिया

7. विश्लेषण का क्यूपीसीआर परिणाम

1) प्रणाली स्वचालित रूप से थ्रेशोल्ड देगा प्रवर्धन प्लॉट पैनल विश्लेषण. दी गई सीमा कभी-कभी सिस्टम द्वारा निर्धारित मान आधार रेखा के बहुत करीब होता है, जिसके परिणामस्वरूप बहुत बड़ा अंतर उत्पन्न होता है सीटी में प्रतिकृति कुओं के बीच। आप मैन्युअल रूप से समायोजित कर सकते हैं थ्रेसहोल्ड को उचित स्थान पर ले जाएं और क्लिक करें विश्लेषण करें। फिर आप शुरू में जाँच कर सकते हैं क्या बहुघटक प्लॉट में प्रवर्धन वक्र सामान्य है।

2) परिणाम में विश्लेषण टैब पर, मानक वक्र प्लॉट की समीक्षा करें। सत्यापित करें R2, दक्षता, ढलान और के लिए मान Y-अवरोधन। एक सामान्य मानक वक्र के लिए, R²>0.99, 90%≤Eff%≤110%, -3.6≤Slope≤-3.1.

3) में 'देखना अच्छी तरह से तालिका 'फलक में विश्लेषण, प्रत्येक नमूने की सांद्रता मात्रा में दिखाए जाते हैं, यूनिट प्रतियाँ/μL है, इकाइयों को परख रिपोर्ट में परिवर्तित किया जा सकता है।

4) पैरामीटर सेटिंग्स परिणाम विश्लेषण विशिष्ट मॉडल और सॉफ्टवेयर पर आधारित होना चाहिए संस्करण इसका प्रयोग किया जाता है, तथा आमतौर पर उपकरण द्वारा इसकी व्याख्या स्वचालित रूप से की जा सकती है।

5) परीक्षण परिणामों के आधार पर स्पाइक रिकवरी दर की गणना करें नमूना टीएस मापा जाना है और नमूना स्पाइक रिकवरी ईआरसी, की रिकवरी दर स्पाइक्स आवश्यक है 50% ~ 150% के बीच होना चाहिए। स्पाइक्ड रिकवरी दर मीटर सूत्र:

वसूली (%) = {Sample spiked assay (eg.copies/μL) - Sample assay (eg.copies/μL)} x निक्षालन आयतन (μL) / सैद्धांतिक डीएनए योग राशि का मूल्य (जैसे.प्रतियां) एक्स 100%।

6) सीटी का मूल्य नकारात्मक नियंत्रण एनसीएस के माध्य से अधिक होना चाहिए सबसे कम सांद्रता Ct  मानक।

7) टेम्पलेट मुक्त नियंत्रण एनटीसी अनिर्धारित या सीटी होना चाहिए मान ≥38.

नोट्स

1. यह प्रॉडक्ट केवल शोध के उपयोग के लिए है।
2. कृपया अपनी सुरक्षा के लिए लैब कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनकर काम करें।

3.कृपया उपयोग करने से पहले इस मैनुअल को ध्यान से पढ़ें इस अभिकर्मक, और प्रयोग को मानकीकृत किया जाना चाहिए, जिसमें शामिल हैं नमूना हैंडलिंग, प्रतिक्रिया प्रणाली तैयारी और नमूना जोड़.

4.सुनिश्चित करें कि उपयोग से पहले प्रत्येक घटक पूरी तरह से भंवरीकृत और कम गति पर अपकेंद्रित्रित हो।

नियमावली