विवरण
रिएक्टिव ऑक्सीजन स्पीशीज एसे किट जीवित कोशिका नमूनों में रिएक्टिव ऑक्सीजन स्पीशीज का मात्रात्मक मूल्यांकन करने के लिए सेल पर्मिएंट अभिकर्मक 2',7'-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन डायसेटेट (DCFDA) का उपयोग करता है। लिपोफिलिक गैर-फ्लोरोसेंट DCFDA निष्क्रिय प्रसार के माध्यम से कोशिका झिल्ली को आसानी से पार कर जाता है, जिसके बाद डीएसिटिलेशन होता है। डीएसिलेटेड उत्पाद एक ऑक्सीडेंट संवेदनशील 2′,7′-डाइक्लोरोफ्लोरेसिन (DCHF) है। DCHF को बाद में ROS द्वारा ऑक्सीकृत करके DCF बनाया जाता है। DCF अत्यधिक फ्लोरोसेंट होता है और इसे 480 nm/525 nm पर उत्तेजना/उत्सर्जन के साथ फ्लोरोसेंस स्पेक्ट्रोस्कोपी या फ्लो साइटोमेट्री द्वारा पता लगाया जाता है। रोसुप, एक यौगिक मिश्रण, एक ROS प्रेरक है और इसे सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
उत्पाद घटक
| घटक संख्या | अवयव | मात्रा | भंडारण |
| 50101-ए | डीसीएफएच-डीए (10 मिमी) | 100 µएल | -20° सेल्सियस |
| 50101-बी | रोसुप (100 मिमी) | 1 एमएल | -20° सेल्सियस |
शिपिंग और भंडारण
यह किट एक आइस बैग के साथ भेजी जाती है। इसे 1 साल तक बिना रोशनी के -20°C पर स्टोर करें। बार-बार जमने और पिघलने से बचें।
आवेदन की विधि
1. अभिकर्मक तैयारी
DCFH-DA समाधान: खोलने से पहले कम गति पर थोड़ी देर के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। 10 μM अंतिम सांद्रता बनाने के लिए सीरम मुक्त माध्यम में 10 mM DCFH-DA को पतला करके एक कार्यशील DCFH-DA समाधान तैयार करें।
[नोट]: DCFH-DA को फिनोल रेड के बिना मीडिया में भी पतला किया जा सकता है। ताजा तैयार DCFH-DA घोल का उपयोग करें, पतला DCFH-DA का दीर्घकालिक भंडारण अनुशंसित नहीं है। आवश्यक DCFH-DA की सटीक सांद्रता उपयोग की जा रही सेल लाइन पर निर्भर करेगी लेकिन एक सामान्य शुरुआती सीमा 10- 50 μM होगी। कुछ कोशिकाओं के लिए, यदि नकारात्मक नियंत्रण (DCFH-DA जांच के बिना) की प्रतिदीप्ति बहुत मजबूत है, तो DCFH-DA को 2-5 μM तक पतला करें और ऊष्मायन समय को छोटा करें उचित रूप से.
रोसुप समाधान: सीरम मुक्त माध्यम में 100 mM रोसुप स्टॉक समाधान को पतला करके 100 µM रोसुप कार्यशील समाधान तैयार करें। आम तौर पर, अंधेरे में 30 मिनट-4 घंटे के लिए 37 ℃ पर रोसुप के साथ ऊष्मायन ROS को काफी हद तक बढ़ा सकता है।
[नोट]: रोसुप का ऊष्मायन समय सेल लाइन की संवेदनशीलता पर निर्भर करेगा। उदाहरण के लिए, हेला के लिए 30 मिनट और MRC5 के लिए 1.5 घंटे। यदि 30 मिनट के भीतर ROS की वृद्धि नहीं देखी जाती है, तो प्रेरण समय या सांद्रता को उचित रूप से बढ़ाया जा सकता है। यदि ROS बहुत तेजी से बढ़ता है, तो प्रेरण समय या सांद्रता को उचित रूप से कम किया जा सकता है।
औषधियाँ: इच्छित औषधि को 10% FBS या अन्य उपयुक्त विलयन के साथ पूर्ण माध्यम में वांछित सान्द्रता तक तैयार करें।
2. आसंजक कोशिकाओं के लिए अनुशंसित प्रोटोकॉल
क) कोशिका तैयारी: प्रयोग से एक दिन पहले मानक कोशिका संवर्धन मीडिया में आसंजक कोशिकाओं को विकसित करें ताकि प्रयोग के समय कोशिका संगम 70% तक पहुंच जाए।
बी) दवा प्रेरण: मीडिया को हटा दें। प्रत्येक वेल को पहले से तैयार सीरम-मुक्त पतला दवाओं के साथ ओवरले करें और अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर वांछित समय के लिए इनक्यूबेट करें।
ग) (वैकल्पिक) सकारात्मक नियंत्रण: पहले से तैयार रोसुप घोल को सकारात्मक नियंत्रण कुएं पर लगाएं और अंधेरे में 37°C पर वांछित समय के लिए इनक्यूबेट करें।
[नोट]: कम उत्तेजना समय (आमतौर पर 2 घंटे के भीतर) वाली कोशिकाओं के लिए, जांच को पहले लोड किया जा सकता है, और फिर रोसुप या रुचि की दवा जोड़ सकते हैं।
d) ROS जांच लोडिंग: सभी माध्यम निकालें और कोशिकाओं को 1-2 बार सीरम-मुक्त माध्यम से धोएँ। प्रत्येक वेल को पहले से तैयार DCFH-DA घोल से ढकें। अंधेरे में 37℃ पर 30 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
ई) माध्यम को हटा दें और मुक्त डीसीएफएच-डीए को हटाने के लिए कोशिकाओं को सीरम मुक्त माध्यम से 1-2 बार धो लें।
3. सस्पेंशन सेल के लिए अनुशंसित प्रोटोकॉल
क) कोशिका तैयारी: प्रयोग के दिन निलंबन कोशिकाओं को प्रति कुण्ड लगभग 1.5 × 105 कोशिकाओं तक बढ़ाएं।
ख) औषधि प्रेरण: कोशिकाओं को अपकेन्द्रण द्वारा एक शंक्वाकार ट्यूब में एकत्रित करें तथा उन्हें पहले से तैयार सीरम-मुक्त तनु औषधियों की उचित मात्रा में पुनः निलंबित करें तथा अंधेरे में 37°C पर वांछित समय के लिए इनक्यूबेट करें।
(सी) (वैकल्पिक) सकारात्मक नियंत्रण: पहले से तैयार रोसुप समाधान के साथ सकारात्मक नियंत्रण कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर वांछित समय के लिए इनक्यूबेट करें।
d) ROS जांच लोडिंग: एक नई ट्यूब में इकट्ठा करें और कोशिकाओं को PBS में दो बार सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा धोएँ। 1×106-2×107/mL पर सेल घनत्व के साथ पहले से तैयार DCFH-DA घोल के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। फिर अंधेरे में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। जांच और कोशिकाओं के बीच पूर्ण संपर्क सुनिश्चित करने के लिए हर 3-5 मिनट में ट्यूब को उल्टा करें।
[नोट]: कोशिका घनत्व को बाद की पहचान विधि के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, फ्लो साइटोमेट्री के लिए, एक ट्यूब में कोशिकाओं की संख्या 104/एमएल से कम या 106/एमएल से अधिक नहीं होनी चाहिए।
ई) मुक्त डीसीएफएच-डीए को हटाने के लिए सीरम मुक्त माध्यम से दो बार सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को एकत्र करें और धोएँ।
4. प्रतिदीप्ति पहचान और डेटा विश्लेषण
फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी माप: फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके फ्लोरोसेन (FITC) के लिए उपयुक्त फ़िल्टर सेट के साथ लाइव सेल माइक्रोस्कोपी करें। कोशिकाओं को चमक के लिए दृश्यमान रूप से स्कोर करें और नियंत्रण और नमूनों के बीच तुलना करें या कोशिकाओं की डिजिटल तस्वीरों के बीच संकेतों की तुलना करने के लिए छवि विश्लेषण विधियों का उपयोग करें।
फ्लो साइटोमेट्री माप: एकल कोशिका निलंबन तैयार करने के लिए आसंजक कोशिकाओं को ट्रिप्सिन के साथ एकत्र किया जाना चाहिए; निलंबन कोशिकाओं के लिए, कोशिकाओं को सीधे एकत्र किया जाता है। आदर्श रूप से, प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति में 10,000 कोशिकाओं का विश्लेषण किया जाना चाहिए। प्रयोग के दौरान कोशिकाओं का घनत्व बहुत अधिक नहीं होना चाहिए (<1 ×106 कोशिकाएँ/एमएल)। मलबे को बाहर निकालें और गेटिंग के साथ रुचि की कोशिका आबादी को अलग करें। औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता का उपयोग करके, Ex/Em = 480/525 nm के साथ नियंत्रण और उपचारित नमूनों के बीच गुना परिवर्तन निर्धारित करें।
फ्लोरोसेंट माइक्रोप्लेट मापन: मीडिया की मौजूदगी में अंतिम बिंदु मोड में Ex/Em = 480/525 nm पर फ्लोरोसेंस प्लेट रीडर पर प्लेट को तुरंत मापें। सभी मापों से रिक्त रीडिंग घटाएँ और परख नियंत्रण से गुना परिवर्तन निर्धारित करें।
चेतावनी
1. पृष्ठभूमि शोर को कम करने के लिए डीसीएफएच-डीए के साथ इनक्यूबेट करने के बाद कोशिकाओं को धो लें।
2. संभावित त्रुटियों से बचने के लिए ऊष्मायन के बाद जितनी जल्दी हो सके प्रतिदीप्ति को मापने की सिफारिश की जाती है।
3. अपनी सुरक्षा और स्वास्थ्य के लिए, कृपया ऑपरेशन के दौरान लैब कोट और डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें।
4. केवल अनुसंधान हेतु उपयोग हेतु!
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