विवरण
प्यूरोमाइसिन एक एमिनोग्लाइकोसाइड एंटीबायोटिक है जो स्ट्रेप्टोमाइसिस एल्बोनिगर के किण्वन और चयापचय द्वारा निर्मित होता है, जो प्रोटीन संश्लेषण को बाधित करके ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया, विभिन्न जानवरों और कीट कोशिकाओं को मारता है। प्यूरोमाइसिन कुछ मामलों में ई. कोली के खिलाफ प्रभावी है। तंत्र यह है कि puromycin एमिनोइल-टीआरएनए अणुओं के 3´ टर्मिनल का एक एनालॉग है, जो राइबोसोम के ए साइट से जुड़ सकता है और विस्तारित पेप्टाइड श्रृंखला में शामिल हो सकता है। ए साइट से जुड़ने के बाद, यह किसी भी बाद की प्रतिक्रियाओं में भाग नहीं लेगा, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन संश्लेषण की समयपूर्व समाप्ति और सी-टर्मिनस पर प्यूरोमाइसिन युक्त अपरिपक्व पॉलीपेप्टाइड्स की रिहाई होगी।
प्यूरोमाइसिन-उत्पादक स्ट्रेप्टोमाइसिस एल्बोनिगर में पाया जाने वाला pac जीन प्यूरोमाइसिन एन-एसिटाइलट्रांसफेरेज़ (PAC) को एनकोड करता है जो प्यूरोमाइसिन के प्रति प्रतिरोध प्रदान करता है। इस गुण का उपयोग अब आम तौर पर pac जीन प्लास्मिड ले जाने वाली स्तनधारी स्थिर रूप से संक्रमित कोशिका रेखाओं की जांच के लिए किया जाता है।
स्थिर कोशिका संक्रमण के चयन में प्यूरोमाइसिन का सामान्य अनुप्रयोग लेंटिवायरल वेक्टर की विशेषताओं से संबंधित है। अधिकांश वाणिज्यिक लेंटिवायरल वेक्टर अब pac जीन ले जाते हैं। कुछ विशिष्ट मामलों में, प्यूरोमाइसिन का उपयोग pac जीन प्लास्मिड ले जाने वाले ई. कोली उपभेदों के परिवर्तन की जांच के लिए भी किया जा सकता है।
यह उत्पाद कोशिका संवर्धन के लिए उपयुक्त है, सामान्य कार्यशील सांद्रता 1-10 µg/mL है।
इसके अलावा, येसेन कंपनी घोल के रूप में प्यूरोमाइसिन (कैट# 60209ES) भी उपलब्ध कराती है, जो अलग अवस्था में होती है लेकिन उसका कार्य वही होता है।
विशेषताएँ
पवित्रता≥98%
अनुप्रयोग
कोशिका संवर्धन के लिए उपयुक्त
एसक्रैन विशिष्ट स्तनधारी स्थिर रूप से संक्रमित कोशिका उपभेद जो पीएसी जीन ले जाने वाले प्लास्मिड ले जाते हैं
स्क्रीन पीएसी जीन प्लास्मिड ले जाने वाले रूपांतरित ई. कोली उपभेद
विशेष विवरण
| CAS संख्या। | 58-58-2 |
| आणविक सूत्र | सी22एच29एन7हे5·2एचसीएल |
| आणविक वजन | 544.43 ग्राम/मोल |
| पवित्रता | ≥98% |
| उपस्थिति | सफेद या हल्का सफेद पाउडर |
| संरचना |
|
अवयव
| घटक सं. | नाम | 60210ईएस25 | 60210ES60 | 60210ES72 | 60210ES76 | 60210ES80 |
| 60210 | प्यूरोमाइसिन डाइहाइड्रोक्लोराइड | 25 मिलीग्राम | 100 मिलीग्राम | 250 मिलीग्राम | 500 मिलीग्राम | 1 ग्राम |
शिपिंग और भंडारण
पीयूरोमाइसिन डीiहाइड्रोक्लोराइड उत्पादों को -15℃ पर संग्रहित किया जाना चाहिए ~ -25℃ के लिए 2 साल।
निर्देश
1. सुझाया गया कार्य एकाग्रता
स्तनधारी कोशिकाएँ: 1-10 μग्राम/एमएल, इष्टतम सांद्रता को मारक वक्र द्वारा निर्धारित करने की आवश्यकता है।
एस्चेरिचिया कोली: एलबी अगर माध्यम का उपयोग एस्चेरिचिया कोली को 125 की सांद्रता पर पीएसी जीन के साथ स्थिर रूप से रूपांतरित करने के लिए किया गया था μग्राम/एमएल.
टिप्पणी: प्यूरोमाइसिन का उपयोग करके स्थिर ई. कोली उपभेदों की जांच के लिए सटीक पीएच समायोजन की आवश्यकता होती है।
अनुशंसित सांद्रता puromycin हाइड्रोक्लोराइड
| सीईएल लाइन | एकाग्रता | संदर्भ |
| बी16 | 1-2 μग्राम/एमएल | [1],[2] |
| HEK293 | 0.5-10 μग्राम/एमएल | [3] |
| हेला | 1-10 μग्राम/एमएल | [4],[5] |
| एमईएफ | 1-5 μग्राम/एमएल | [4] |
| हेपजी2 | 0.5-5 μग्राम/एमएल | [6],[7] |
| ए549 | 1.5 μग्राम/एमएल | [8] |
| एचमानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससीएस) | 0.5-5 μग्राम/एमएल | [9] |
2. विघटन विधि
50 मिलीग्राम/एमएल का स्टॉक घोल तैयार करने के लिए आसुत जल में प्यूरोमाइसिन को घोलें। 0.22 के माध्यम से निस्पंदन द्वारा स्टरलाइज़ करने के बाद μएम फिल्टर झिल्ली, विभाज्य और -25 से -15 पर स्टोर℃वैकल्पिक रूप से, इसे मेथनॉल में घोलकर 10 मिलीग्राम/एमएल का भंडारण घोल तैयार किया जा सकता है।
3. का निर्धारण puromycin मारक वक्र (उदाहरण के लिए shRNA अभिकर्मक या लेन्टिवायरस अभिकर्मक लेना)
प्रभावी स्क्रीनिंग सांद्रता puromycin सेल प्रकार, वृद्धि अवस्था, सेल घनत्व, सेल चयापचय और सेल चक्र स्थिति से संबंधित है। shRNA सेल लाइनों को स्थिर रूप से व्यक्त करने के लिए, प्यूरोमाइसिन की न्यूनतम सांद्रता निर्धारित करना महत्वपूर्ण है जो अनट्रांसफ़ेक्टेड/ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को मारता है। यह अनुशंसा की जाती है कि जो ग्राहक पहली बार प्रयोग कर रहे हैं, उन्हें अपने स्वयं के प्रयोगात्मक सिस्टम के लिए उपयुक्त किल कर्व स्थापित करना चाहिए।
1) दिन 1: 24-वेल प्लेट को 5 के घनत्व पर चढ़ाया जाता है-8×104 कोशिकाएं/वेल, और बाद के ग्रेडिएंट प्रयोगों के लिए पर्याप्त संख्या में वेल प्लेट किए गए। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट किया गया।℃.
2) दिन 2: ए) स्क्रीनिंग माध्यम तैयार करें: प्यूरोमाइसिन की विभिन्न सांद्रता युक्त ताजा माध्यम (जैसे 0-15 μजी/एमएल, कम से कम 5 ग्रेडिएंट); बी) रात भर ऊष्मायन के बाद कोशिकाओं में ताजा तैयार स्क्रीनिंग माध्यम को बदलें; फिर कोशिकाओं को 37 पर ऊष्मायन किया जाता है℃.
3) दिन 4: ताजा चयन माध्यम से प्रतिस्थापित करें और कोशिका व्यवहार्यता का निरीक्षण करें।
4) कोशिकाओं की वृद्धि अवस्था के आधार पर, हर 2-3 दिन में ताजा चयन माध्यम बदलें।
5) एंटीबायोटिक स्क्रीनिंग की शुरुआत के 4-6 दिनों के भीतर गैर-ट्रांसफ़ेक्टेड या सभी गैर-ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं को मारने के लिए प्रभावी दवा की न्यूनतम सांद्रता निर्धारित करने के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं की दर का निरीक्षण करने के लिए कोशिकाओं की दैनिक निगरानी की गई।
4. स्तनधारी स्थिर रूप से संक्रमित कोशिका रेखाओं की जांच
पीएसी जीन युक्त प्लाज्मिड के ट्रांसफेक्शन के बाद, स्थिर ट्रांसफेक्टेंट्स का चयन करने के लिए कोशिकाओं को प्यूरोमाइसिन युक्त माध्यम में प्रसारित किया गया।
1) अभिकर्मन के 48 घंटे बाद, कोशिकाओं (मूल या तनुकृत) को प्यूरोमाइसिन की उचित सांद्रता वाले ताजे माध्यम में संवर्धित किया जाता है।
नोट:एंटीबायोटिक्स तब सबसे ज़्यादा प्रभावी होते हैं जब कोशिकाएँ सक्रिय रूप से विभाजित हो रही होती हैं। अगर कोशिकाएँ बहुत घनी हैं, तो एंटीबायोटिक्स की प्रभावशीलता काफ़ी कम हो जाएगी। कोशिकाओं को 25% से ज़्यादा घनत्व पर प्लेट करना सबसे अच्छा है।
2) युक्त संवर्धन माध्यम को हटाएँ और बदलें puromycin हर 2-3 दिन में।
3) स्क्रीनिंग के 7 दिन बाद सेल-निर्मित फ़ॉसी का मूल्यांकन किया जाता है। मेजबान सेल लाइन और ट्रांसफ़ेक्शन स्क्रीनिंग दक्षता के आधार पर घावों को एक अतिरिक्त सप्ताह या उससे अधिक की आवश्यकता हो सकती है।
नोट: हर दिन कोशिका वृद्धि की स्थिति का निरीक्षण करें। प्यूरोमाइसिन की स्क्रीनिंग के लिए कम से कम 48 घंटे की आवश्यकता होती है, और प्यूरोमाइसिन की प्रभावी सांद्रता की स्क्रीनिंग अवधि आम तौर पर 3-10 दिन होती है।
4) 5-10 प्रतिरोधी क्लोनों को 35 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और 7 दिनों के लिए चयन माध्यम के साथ संवर्धन जारी रखें। यह संवर्धन संवर्धन भविष्य के साइटोटॉक्सिसिटी प्रयोग के लिए तैयार करना है.
दस्तावेज़:
सुरक्षा डेटा पत्रक
60210_एमएसडीएस_HB220421_EN.pdf
नियमावली
उद्धरण एवं संदर्भ:
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[3] रोसगर के. एट अल., 2013. सिंथेटिक ब्रेन-डोपामाइन इंटरफ़ेस द्वारा पुरस्कार-आधारित उच्च रक्तचाप नियंत्रण। पीएनएएस, 110:18150-5.
[4] केमर आई. एट अल., 2005. प्रोएपोप्टोटिक बीआईडी डीएनए-क्षति प्रतिक्रिया सेल में एक एटीएम प्रभावकारक है। 122:593-603.
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