विवरण
जी418 सल्फेट, जिसे जेनेटिसिन सल्फेट के नाम से भी जाना जाता है, एक एमिनो-ग्लाइकोसाइड एंटीबायोटिक है और संरचनात्मक रूप से जेंटामाइसिन बी1 के समान है। यह 80s राइबोसोम को बांधकर और बढ़ाव चरणों को अवरुद्ध करके प्रोटीन संश्लेषण में हस्तक्षेप करता है। जी418 सल्फेट प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक दोनों कोशिकाओं के लिए विषाक्त है, जिसमें बैक्टीरिया, खमीर, उच्च पौधे और स्तनधारी कोशिकाएं, साथ ही प्रोटोजोआ और कृमि शामिल हैं। ट्रांसपोसॉन Tn601 (903) या Tn5 में स्थित प्रतिरोध जीन (मुख्य रूप से नियो), बैक्टीरिया से प्राप्त होता है, लेकिन यूकेरियोटिक कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है। प्रतिरोध जीन को जीन पुनर्संयोजन तकनीकों के माध्यम से कोशिकाओं में पेश किया जा सकता है ताकि G418 का प्रतिरोध प्राप्त किया जा सके, जिसका उपयोग प्रतिरोध जीन ले जाने वाले प्रोकैरियोटिक या यूकेरियोटिक कोशिकाओं की संस्कृति को स्क्रीन करने और बनाए रखने के लिए किया जा सकता है।
स्तनधारी कोशिकाओं में, नियो, यूकेरियोटिक जीनोम में एकीकृत होने के बाद एमिनो-ग्लाइकोसाइड 3'-फॉस्फोट्रांसफेरेज (APH (3') II) की अभिव्यक्ति को एनकोड करता है। यह एंजाइम G418 के एमिनो या हाइड्रॉक्सिल फ़ंक्शन को सहसंयोजक रूप से संशोधित करके और एंटीबायोटिक-राइबोसोम इंटरैक्शन को बाधित करके एंटीबायोटिक को निष्क्रिय कर देता है, जिससे कोशिका को G418 प्रतिरोध प्राप्त होता है। स्थिर सेल लाइन प्रयोगों की स्क्रीनिंग में, गैर-प्रतिरोधी कोशिकाओं को मारने के लिए न्यूनतम प्रभावी सांद्रता निर्धारित करने के लिए मारक वक्र (खुराक-प्रतिक्रिया वक्र) स्थापित किए जाने चाहिए।
पौधों की कोशिकाओं में, nptII जीन प्रतिरोधी प्लास्मिड के संक्रमण द्वारा प्रतिरोध प्राप्त किया जा सकता है। nptII जीन एमिनोग्लाइकोसाइड फॉस्फोट्रांसफेरेज को भी एनकोड करता है, जो एक एंजाइम है जो G418, कैनामाइसिन और पालोमाइसिन सहित कई एंटीबायोटिक्स को निष्क्रिय करता है।
विशेषताएँ
पवित्रता≥98%
मानकीकृत उत्पादन, फैक्ट्री बड़े पैमाने पर उत्पादन मोड का उपयोग करना
अनुप्रयोगों की विस्तृत श्रृंखला, जिसका उपयोग आणविक जीव विज्ञान और ऊतक संवर्धन के जैव रासायनिक प्रयोगात्मक अनुसंधान के क्षेत्र में किया जा सकता है
सहयोग मंच सम्पूर्ण को कवर करता है
उत्पाद की गुणवत्ता स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए, बैचों के बीच अंतर को 1% के भीतर नियंत्रित किया जाता है
अनुप्रयोग
स्थिर रूप से ट्रांसफ़ेक्टेड सेल लाइनों की स्क्रीनिंग
विशेष विवरण
| CAS संख्या। | 108321-42-2 |
| आणविक सूत्र | सी20एच40एन4हे10·2एच2इसलिए4 |
| आणविक वजन | 692.7 ग्राम/मोल |
| पवित्रता | ≥98% |
| शक्ति（निर्जल） | > 700 यू/एमजी |
| उपस्थिति | सफेद या हल्का सफेद पाउडर |
| घुलनशीलता | H में घुलनशील2हे |
| संरचना |
|
अवयव
| घटक सं. | नाम | 60220ईएस03 | 60220ईएस08 |
| 60220 | G418 सल्फेट (जेनेटिसिन) | 1 ग्राम | 5 ग्राम |
शिपिंग और भंडारण
G418 सल्फेट (जेनेटिसिन) उत्पादों को -15℃ पर संग्रहित किया जाना चाहिए ~ -25℃ के लिए 3 साल।
निर्देश
1. G418 भंडारण समाधान की तैयारी (50 मिलीग्राम/एमएल, सक्रिय सांद्रता)
1) गतिविधि इकाइयों का रूपांतरण
रूपांतरण इस सूत्र के अनुसार किया गया: (1000/A0) ×A1=A2
A0: G418 का पोटेंसी मान, जो बैच दर बैच अलग-अलग होता है। बैच क्वालिटी रिपोर्ट या बोतल पर लेबल देखें।
A1: सक्रिय G418 की वह सांद्रता जो आप चाहते हैं।
A2: G418 की वास्तविक सांद्रता.
उदाहरण के लिए, यदि बैच का G418 गतिविधि मान 750 U/mg है और G418 की सक्रिय सांद्रता 50 mg/mL है, तो तैयार किया जाने वाला वास्तविक पाउडर सांद्रता 1000/750×50 mg/mL=66.67 mg/mL है। यदि 10 mL G418 स्टोरेज सॉल्यूशन (सक्रिय सांद्रता, 50 mg/mL) तैयार किया जाता है, तो 666.7 mg पाउडर का वजन किया जाना चाहिए।
2) बंध्यीकरण और संरक्षण
उपरोक्त रूपांतरण से प्राप्त वास्तविक पाउडर का वजन करें और इसे पूरी तरह से घुलाने के लिए 10 एमएल जीवाणुरहित विआयनीकृत जल मिलाएं।
0.22μm सुई फिल्टर को 5 mL जीवाणुरहित विआयनीकृत जल से पूर्व गीला करें, और फिर निस्पंदन द्वारा G418 विलयन को जीवाणुरहित करें।निष्फल G418 घोल को विभाजित करें और -20°C पर भण्डारित करें।
नोट: ① बादल वाले घोल को फ़िल्टर न करें, क्योंकि घोल पूरी तरह से घुला नहीं है, फ़िल्टरेशन प्रक्रिया से दवा की हानि होगी, अंतिम घोल की गतिविधि कम हो जाएगी। ② भंडारण समाधान तैयार करने के लिए संस्कृति मीडिया, फॉस्फेट समाधान या कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग करने की अनुशंसा नहीं की जाती है।
2. आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली स्क्रीनिंग सांद्रता
सामान्य तौर पर, स्क्रीनिंग ट्रांसफ़ॉर्मर के लिए शुरू में G418 की उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है और कल्चर को बनाए रखने के लिए कम सांद्रता का उपयोग किया जाता है। विकास की स्थिति, कोशिका प्रकार और अन्य पर्यावरणीय कारक G418 की प्रभावी खुराक को प्रभावित कर सकते हैं, इसलिए किलिंग कर्व (खुराक-प्रतिक्रिया वक्र) के माध्यम से इष्टतम स्क्रीनिंग सांद्रता निर्धारित करने की सिफारिश की जाती है।
आम तौर पर, स्तनधारी कोशिकाओं की स्क्रीनिंग रेंज 200-2000 μg/mL, पादप कोशिका: 10-100 μg/mL, यीस्ट कोशिका: 500-1000 μg/mL है।
सेल लाइन प्रायोगिक डेटा
| कोशिका प्रकार | एकाग्रता को सक्रिय करें | आवेदन | संदर्भ |
| Dictyostelium | ए) 10 μg/एमएल बी) 30 माइक्रोग्राम/एमएल | क) माध्यम में संस्कृति बी) लाइओफिलाइज्ड बैक्टीरिया पर संवर्धन | हिर्थ, एट अल., प्रोक. नेशनल. एकेड. साइंस., 79, 7356-7360 (1982). |
| स्तनपायी प्रजातियाँ | ए) 400 -1000 μg/एमएल बी) 200 माइक्रोग्राम/एमएल | a) स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता है ख) रखरखाव के लिए उपयोग किया जाता है | कनानी और बर्ग, प्रोक. नेशनल. एकेड. साइंस., 79, 5166-5170 (1982). |
| पौधा | क) 25-50 μg/mL बी) 10 μg/एमएल | a) स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता है ख) रखरखाव के लिए उपयोग किया जाता है | उर्सिक, एट अल., बायोकैम. बायोफिज़. रिसर्च. कम्यूनिकेशन, 101:3, 1031-1037 (1981). |
| यीस्ट | ए) 500 μg/एमएल बी) 125-200 μg/mL | a) स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता है ख) रखरखाव के लिए उपयोग किया जाता है | जिमेनेज़ और डेविस, प्रकृति, वि. 287, 869-871 (1980). |
| जीवाणु | 16 माइक्रोग्राम/एमएल | स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जाता है | वेट्ज, एट अल., रोगाणुरोधी एजेंट कीमोथेरपी, वि. 6:5, 579-581 (1974). |
3. मारक वक्र की स्थापना
नोट:लक्ष्य प्रोटीन की स्थिर अभिव्यक्ति वाली सेल लाइनों की स्क्रीनिंग के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं की न्यूनतम सांद्रता निर्धारित करना आवश्यक है जो असंक्रमित मेजबान कोशिकाओं को मार सकती हैं। इसे मारने वाले वक्र (खुराक-प्रतिक्रिया वक्र) की स्थापना करके प्राप्त किया जा सकता है। कम से कम छह सांद्रता का चयन किया जाना चाहिए। माइटोटिक सेल का इलाज करते समय G418 सबसे अधिक सक्रिय होता है, इसलिए G418 को जोड़ने से पहले कोशिकाओं को कुछ समय के लिए संवर्धित करने की आवश्यकता होती है।
1) दिन 1: अपरिवर्तित कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर 20-25% सेल घनत्व के साथ एक उपयुक्त संवर्धन प्लेट पर रखा जाता है और CO में रात भर संवर्धित किया जाता है2;
नोट: जिन कोशिकाओं की जीवनक्षमता का पता लगाने के लिए उच्च घनत्व की आवश्यकता होती है, उनके लिए टीकाकरण की मात्रा बढ़ाई जा सकती है।
2) सेल प्रकार के अनुसार G418 सांद्रता ढाल को उचित सीमा में सेट करें। स्तनधारी कोशिकाओं को 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL पर सेट किया जा सकता है।
3) दिन 2: पुराने माध्यम को हटा दें और उसकी जगह दवाओं की संगत सांद्रता वाले नए तैयार माध्यम को डालें। प्रत्येक सांद्रता के लिए तीन समानांतर बनाएं।
4) फिर हर 3-4 दिन में G418 युक्त ताजा मीडिया से प्रतिस्थापित करें।
5) उचित सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक निश्चित चक्र (जैसे, हर 2 दिन) पर जीवित कोशिका गणना की जाती है। स्थिर ट्रांसफ़ेक्शन सेल स्क्रीनिंग के लिए कार्यशील सांद्रता के रूप में न्यूनतम सांद्रता चुनें, जो आदर्श दिनों (आमतौर पर 7-10 दिन) के भीतर अधिकांश कोशिकाओं को मार देती है।
4. स्थिर ट्रांसफ़ेक्टेड कोशिकाओं की स्क्रीनिंग
1) अभिकर्मक के 48 घंटे बाद, उपसंस्कृति (प्रत्यक्ष उपसंस्कृति या तनु उपसंस्कृति) के लिए उपयुक्त सांद्रता वाले G418 संवर्धन माध्यम का उपयोग किया गया।
नोट: अच्छे स्क्रीनिंग परिणाम प्राप्त करने के लिए, कोशिकाओं को 25% से अधिक पतला नहीं करने की सिफारिश की जाती है।
2) औषधियों से युक्त स्क्रीनिंग माध्यम को हर 3-4 दिन में बदलें।
3) स्क्रीनिंग के 7 दिनों के बाद सेल कॉलोनी-गठन को मापें। होस्ट सेल के प्रकार, ट्रांसफ़ेक्शन और स्क्रीनिंग प्रभावशीलता के आधार पर कॉलोनी गठन में एक और सप्ताह या उससे अधिक समय लग सकता है।
4) 5-10 प्रतिरोधी क्लोनों का चयन किया गया और उन्हें 35 मिमी सेल कल्चर प्लेटों में स्थानांतरित किया गया, और 7 दिनों के लिए दवा युक्त स्क्रीनिंग माध्यम के साथ संवर्धित किया गया।
5) सामान्य माध्यम से प्रतिस्थापित करें।
दस्तावेज़:
सुरक्षा डेटा पत्रक
60220_एमएसडीएस_HB220421_EN.pdf
नियमावली
आंकड़ों
चित्र 1.विभिन्न बैचों के बीच जीनोमाइसिन की प्रभावी सांद्रता का स्थिरता परीक्षण और सत्यापन
प्रायोगिक प्रजाति: ई. कोली
G69 और G99 दो अलग-अलग बैच हैं
जीनोमाइसिन की उपयोग सांद्रता क्रमशः 8 मिलीग्राम/लीटर, 12 मिलीग्राम/लीटर और 16 मिलीग्राम/लीटर निर्धारित की गई, और प्रभावी न्यूनतम सांद्रता 16 मिलीग्राम/लीटर निर्धारित की गई, जिसने विविध बैक्टीरिया के विकास को पूरी तरह से बाधित कर दिया। दोनों बैचों का प्रदर्शन सुसंगत था।
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