Artikel ini menjelaskan penerapan Concanavalin A dan penggabungan kovalennya dengan manik magnetik.
Bagian 1. Konkanavalin A
Manik Magnetik Berlapis Concanavalin A (ConA beads), seperti namanya, adalah manik biomagnetik yang di dalamnya terdapat lektin tanaman Concanavalin A (ConA) yang dipadukan dengan nanomaterial superparamagnetik. Berikut ini adalah pengantar singkat tentang ConA Magnetic Beads.
Concanavalin A (ConA), protein lektin tumbuhan tanpa spesifisitas golongan darah, merupakan protein lektin tumbuhan pertama yang diisolasi, dimurnikan, dan dikristalkan dari kacang sotong (Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum) sejak tahun 1936.
ConA memiliki 2 bentuk utama tergantung pada pH larutan tempat ia berada: homodimer α-2 atau homotetramer α-4 [2]. Dalam kondisi basa (pH>7,0) ia ada sebagai tetramer (terdiri dari empat subunit dengan berat molekul 26 kDa); dalam kondisi asam (pH 4,5-5,5) Con A terdisosiasi menjadi struktur dimerik yang aktif (52 kDa). Selain itu, fungsi ConA dipengaruhi oleh kation divalen, misalnya, tanpa adanya ion logam (Ca2+ dan Mn2+), konformasi dan fungsi pengikatan glikoproteinnya tidak dapat direalisasikan[1[Bahasa Indonesia].
Gambar (1). Pemodelan molekular (A) monomer ConA, (B) dimer ConA, (C) tetramer ConA dengan mannosa, glukosa dan ion logam.
Bagian 2. Manik-manik
Manik-manik biomagnetik merupakan kelas mikrosfer magnetik dengan ukuran partikel nanometer, yang dibentuk oleh polimer dan nanopartikel magnetik anorganik. Manik-manik magnetik dapat diklasifikasikan ke dalam tiga kategori utama menurut strukturnya: struktur tipe inti-kulit, struktur tipe sandwich, dan struktur tipe difusi. Bahan magnetik meliputi bubuk besi murni, besi karbonil, bijih magnetik, ortoferit, dan paduan besi kobalt, dan lain-lain.
Nanomaterial magnetik, karena efek khususnya, seperti efek ukuran kecil, efek permukaan dan efek ukuran kuantum, dll., dalam ukuran Fe3HAI4 nanopartikel berukuran kurang dari 30 nm, interferensi gangguan termal di dalam nanopartikel cukup signifikan, dan pada saat ini, nanopartikel ini menunjukkan sifat magnetik khusus, yaitu superparamagnetisme. Fe superparamagnetik3HAI4 nanopartikel banyak digunakan dalam industri biologi karena sifat-sifatnya yang berkualitas tinggi, seperti tidak beracun, biokompatibilitas yang baik, sifat penargetan magnetik yang unik, dan kemudahan pembangkitan panas dalam medan magnet bolak-balik.
Sebaliknya, penggabungan kovalen ConA dengan mikrosfer untuk imobilisasi biomolekul memiliki keuntungan sebagai berikut:
- Stabilitas tinggi ikatan kovalen untuk reproduktifitas;
- Pengikatan Ligand ConA pada permukaan mikromanik untuk interaksi molekul target;
- Karakterisasi kinetik lingkungan larutan, cocok untuk manipulasi eksperimen biologi；
Bagian 3. Aplikasi manik magnetik ConA
Sebagaimana dilaporkan dalam literatur, aplikasi utama manik magnetik ConA dikategorikan ke dalam 3 skenario, yaitu melakukan pemisahan membran sitoplasma, pengayaan glikoprotein, dan pemisahan aspek seluler yang diimobilisasi.
Aplikasi I: Pemisahan membran sitoplasma
Menggunakan manik magnetik ConA yang dipengaruhi oleh aktivasi kation divalen, sehingga ada di Ca2+ dan Mg2+ lingkungan larutan, yang memiliki fungsi interaksi afinitas terminal α-D-manosil dan α-D-glukosil, yang digunakan dalam pemurnian membran plasma, merupakan cara yang sederhana dan efisien. Misalnya, pemisahan sel atau jaringan dari membran plasma merupakan langkah kunci untuk mendapatkan protein membran plasma lebih lanjut. ConA mampu mengikat protein glikosilasi pada sel, dan prinsip ini dapat digunakan untuk mendapatkan membran plasma dengan kemurnian yang lebih tinggi. Langkah-langkah operasi utamanya adalah: imobilisasi ConA pada manik-manik magnetik dengan mengikat ConA yang terbiotinilasi ke manik-manik magnetik streptavidin; inkubasi membran sel dengan manik-manik magnetik ConA selama 1 jam; adsorpsi pada rak magnetik; pencucian dengan TBS sebanyak 5 kali; dan elusi larutan membran sitoplasma dengan eluen[3].
Gambar 2. Langkah-langkah pemurnian manik magnetik ConA untuk membran plasma
Aplikasi II: Pengayaan Glikoprotein
ConA bersifat spesifik untuk mannosa dan glukosa serta mengenali mannosa terkonjugasi α, yang merupakan "oligosakarida inti" dari banyak glikoprotein serum dan membran sel. Oleh karena itu, ConA dapat digunakan dalam imunologi untuk memisahkan molekul glikosilasi seperti glikoprotein dalam lisat sel atau jaringan atau serum.
Prosedur utama adalah bahwa dengan cara mengikat silang mutiara nano magnetik aminosilanisasi (MNP) dengan ConA melalui penghubung bifungsional, bis-N-hydroxysuccinimide linoleate (DSS), untuk memperoleh manik-manik magnetik ConA; untuk mengakhiri ikatan non-spesifik dari mutiara nano magnetik menggunakan methoxyethylene glycol (MEG), dan untuk melakukan pemisahan magnetik; untuk menambahkan ekstrak protein membran sel yang dicerna dengan tripsin untuk menginkubasi manik-manik magnetik ConA dan glikopeptida yang ditangkap, dan akhirnya untuk mengelusi glikopeptida yang ditangkap, dan untuk melakukan pengeringan vakum. Manik-manik magnetik ConA diinkubasi, manik-manik magnetik ConA yang telah mengikat glikoprotein dikumpulkan oleh rak magnetik, non-glikopeptida dicuci, dan akhirnya glikopeptida yang ditangkap dielusi dan dikeringkan dengan vakum. Metode ini memungkinkan analisis mendalam dari situs glikosilasi spesifik dari protein yang terkait dengan tumor (misalnya, EGFR)[4].
Gambar 3. Nanopartikel superparamagnetik yang digabungkan dengan lektin yang berbeda
Aplikasi III: Isolasi sel yang diimobilisasi
Penggunaan manik-manik magnetik ConA (manik-manik magnetik yang terikat secara kovalen dengan Concanavalin A yang memiliki kemurnian tinggi) untuk mengikat glikoprotein pada membran sel atau membran inti, sehingga menangkap sel atau inti, memungkinkan visualisasi manipulasi eksperimental sejumlah kecil sel. Misalnya, manik-manik magnetik ConA digunakan dalam CUT&Tag dan CUT&RUN [5] eksperimen, yang merupakan teknik baru yang digunakan untuk mempelajari struktur dan fungsi kromatin, dan diimobilisasi dengan mengikat manik-manik magnetik ConA ke sel untuk memvisualisasikan operasi dan menghindari masalah hilangnya sel yang disebabkan oleh sentrifugasi.
Dibandingkan dengan teknologi ChIP-seq tradisional untuk mempelajari interaksi DNA-protein, CUT&Tag dan CUT&RUN memiliki keunggulan sebagai berikut:
- Manik-manik magnetik ConA mengikat glikoprotein membran sel untuk memvisualisasikan operasi dan meningkatkan pengalaman operasi eksperimental;
- Tidak perlu sentrifugasi, cukup manik-manik magnetik ConA yang diserap pada rak magnetik untuk menyelesaikan pemisahan sampel dan larutan sel;
- Dapat dioperasikan dengan 10 sel saja, sehingga tidak memerlukan sampel dalam jumlah besar untuk ChIP-seq.
Gambar 4. Diagram skema aliran eksperimen ChIP-seq, CUT&Tag, CUT RUN
Bagian 4.
Manik-manik magnetik ConA, dikembangkan oleh
1.Fitur Produk
- Produksi batch yang stabil dan reproduktifitas hasil yang lebih baik;
- Penyimpanan kinerja yang stabil
- Efisiensi penangkapan sel>90%
2.Informasi Produk
| Kucing NO. | Kucing#19810ES |
| Ukuran | 1 ml/5 ml/20 ml |
| Warna | Kuning kecoklatan |
| Konsentrasi manik-manik | 10 mg/ml |
| Konten padat | 9-11 mg/ml |
| Ukuran manik-manik | 1 mikron |
| Kapasitas | 105 sel/µL manik-manik |
3. Data Kinerja Produk
(1)Monodispersitas
Di bawah kondisi perlakuan yang sama dan di bawah pembesaran 10×/40×, manik-manik ConA pada dasarnya terdispersi tunggal, dan tidak ada penggumpalan yang jelas diamati relatif terhadap pesaing.
| | Manik-manik pesaing ConA | |
Gbr. 5. Grafik hasil monodispersitas
(2)Pengaruh pengikatan manik ConA pada sel
Jumlah sel yang sama diinkubasi dengan manik-manik untuk jumlah waktu yang sama, dan jumlah sel yang tersisa setelah konjugasi manik-manik ConA secara otomatis terdeteksi di bawah penganalisa sel, dan hasilnya menunjukkan bahwa
| Suspensi sel | Sel yang tersisa setelah pengikatan manik magnetik ConA kompetitif | Sel yang tersisa setelah pengikatan |
Gbr. 6.Gambar sel yang terikat manik magnetik ConA
(3)Jumlah Pengikatan Sel dan Pengulangan
Baik 10µL
Gbr. 7. Hasilnya jumlah sel pengikat manik ConA dan tingkat penangkapan
(4)Stabilitas Akselerasi
Dispense pada 1 mL/tabung. Kondisi penyimpanan adalah: perlakuan dipercepat 4℃, 37℃ selama 2, 4, 7, 11 dan 14 hari, dan perlakuan penghancuran -20℃ selama 1, 3, 6 dan 8 hari. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dalam kondisi eksperimen yang sama: laju penangkapan sel dari produk yang disimpan pada suhu 4℃, perlakuan dipercepat pada suhu 37℃ dan perlakuan penghancuran pada suhu -20℃ adalah >95%, dan nilai CV dari tiga kelompok replikasi dalam setiap kondisi perlakuan berada dalam kisaran 1%, yang menunjukkan reproduktifitas yang baik.
Gambar 8. Hasil Tingkat penangkapan sel dan bias pengulangan manik ConA pada suhu dan waktu yang berbeda
Informasi pemesanan
| tahun 19810 |