UCF.ME ™ Salt Active Ultranuclease: Secara efektif mengurangi residu asam nukleat inang menjadi pg-grade di lingkungan garam tinggi

Pusat Evaluasi Obat (CDE) Badan Pengawas Produk Medis Nasional telah menyatakan dengan jelas dalam pedomannya untuk produk terapi gen bahwa jumlah residu DNA dan ukuran fragmen residu perlu dikendalikan, dan merekomendasikan agar ukuran fragmen residu DNA dikendalikan di bawah 200 bp sebisa mungkin. Oleh karena itu, penghilangan asam nukleat residu dalam biofarmasi sangat penting. Dengan meningkatnya kompleksitas proses produksi, penghilangan asam nukleat residu secara efektif dalam lingkungan dengan kadar garam tinggi menghadapi banyak tantangan baru:

  • Selama proses pemurnian virus AAV, untuk meningkatkan pemulihan virus, buffer dengan konsentrasi garam yang lebih tinggi (200-500 mM) sering digunakan. Namun, nuklease konvensional menunjukkan penurunan aktivitas yang signifikan dengan peningkatan konsentrasi garam. Jika efek pemurnian ditingkatkan dengan meningkatkan jumlah enzim dan waktu inkubasi, biaya yang dikeluarkan akan sangat meningkat.
  • DNA inang biasanya ada dalam bentuk kromatin dan mudah dibungkus oleh protein, sehingga DNA tidak dapat diakses. Dalam lingkungan dengan kadar garam tinggi, asam nukleat dan protein dapat terpisah secara efektif, sehingga dapat membuang asam nukleat sisa dengan lebih baik.
  • Vektor virus seperti AAV dapat beragregasi karena interaksi elektrostatik, dan agregasi ini lebih mungkin terjadi pada kekuatan ionik rendah dan kondisi DNA residual, yang menyebabkan berkurangnya stabilitas dan memengaruhi hasil. Peningkatan konsentrasi garam dapat secara efektif mengurangi agregasi partikel virus AAV, meningkatkan tingkat pemulihan partikel virus AAV.

Salt Active UltraNuclease (nuklease spektrum luas yang toleran terhadap garam) adalah endonuklease non-spesifik rekombinan yang berasal dari mikroorganisme laut. Dibandingkan dengan UltraNuclease, ia menunjukkan aktivitas optimal pada konsentrasi garam 500 mM dan dapat secara efisien menghilangkan kontaminasi asam nukleat bahkan di lingkungan dengan kadar garam tinggi.

Skenario Aplikasi Produk

  1. Penghapusan Residu Asam Nukleat dalam Biologi: Selama produksi biologi, seperti virus, vaksin, dan protein, UltraNuclease dapat ditambahkan untuk mendegradasi residu asam nukleat. Langkah ini tidak hanya meningkatkan hasil produksi virus tetapi juga secara signifikan mengurangi kandungan residu asam nukleat, sehingga memastikan keamanan dan kemanjuran obat.
  2. Pengurangan Viskositas: Dengan mendegradasi asam nukleat, viskositas lisat sel berkurang, yang memfasilitasi proses filtrasi/ultrafiltrasi selama pemurnian partikel yang berasal dari sel seperti virus, vektor AAV, dan badan inklusi.
  3. Peningkatan Resolusi dan Pemulihan: Dalam analisis ELISA, elektroforesis dua dimensi, dan imunoblotting, ini meningkatkan resolusi dan pemulihan.
  4. Pencegahan Agregasi Sel: UltraNuclease dapat secara efektif mencegah agregasi sel mononuklear darah tepi manusia (PBMC).

Pengujian kinerja produk

Pengaruh lingkungan garam tinggi terhadap aktivitas enzim (Na+)

Untuk mencocokkan penggunaan Salt Active UltraNuclease, Yeasen juga telah secara independen mengembangkan kit deteksi khusus untuk Garam Aktif UltraNuklease, yang dapat mendeteksi residu enzim secara efektif dan mengurangi risiko. Kit ELISA Salt Active UltraNuclease dikembangkan dan diproduksi sesuai dengan pedoman validasi metode analisis <9101> dari Farmakope Tiongkok 2020, yang secara ketat mematuhi persyaratan utama untuk pengujian multiparameter (rentang linier, spesifisitas, akurasi, presisi, sensitivitas, stabilitas yang dipercepat, dll.).

Untuk tujuan ini, Yeasen Biotech telah mengembangkan kit ELISA untuk mendeteksi Salt Active UltraNuclease. Kit ini menggunakan prinsip double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) untuk mendeteksi jumlah residu Salt Active UltraNuclease. Sampel standar dan sampel uji Salt Active UltraNuclease ditambahkan ke pelat berlapis enzim yang telah dilapisi antibodi anti-Salt Active UltraNuclease (36703-A). Kemudian, antibodi pendeteksi nuklease berlabel biotin yang diencerkan (36703-C) ditambahkan, diikuti oleh Streptavidin-HRP (SA-HRP) (36703-D). Ini membentuk kompleks antibodi + antigen + antibodi-biotin + SA-HRP. Setelah mencuci pelat, larutan substrat TMB (36703-H) ditambahkan untuk pengembangan warna. Di bawah katalisis enzim HRP, TMB berubah dari tidak berwarna menjadi biru dan akhirnya berubah menjadi kuning di bawah aksi larutan penghenti (36703-I). Intensitas warna kuning berbanding lurus dengan jumlah nuklease universal toleran garam tinggi yang terdeteksi dalam sampel.

Proses eksperimental untuk mendeteksi residu Salt Active UltraNuclease menggunakan Salt Active UltraNuclease ELISA Kit.

Karakteristik kit ELISA UltraNuclease dan Salt Active UltraNuclease:

Kepatuhan terhadap Peraturan: Sepenuhnya divalidasi sesuai dengan persyaratan peraturan, laporan validasi tersedia;

Jaminan Kualitas: Semua bahan baku untuk kit ini dikembangkan secara independen, memastikan kualitas yang dapat dikontrol;

Sensitivitas Tinggi: Batas kuantitatif serendah 23 pg/mL;

Presisi Tinggi: Pengulangan intra-batch yang tinggi dan variabilitas antar-batch yang rendah;

Spesifisitas Kuat: Tidak ada reaksi silang dengan protein sel rekayasa lainnya

Parameter kinerja

Parameter produk

isi

Waktu pengujian

3,5jam

Prinsip pengujian

Uji imunoenzimetri dua situs

Penguatan sinyal

Sistem biotin-streptavidin

Panjang gelombang deteksi

450nm dan 630nm

Kepekaan

0,024 ng/ml

Jangkauan deteksi

0.047 ng/ml~3 ng/ml

Objek deteksi

Garam Aktif UltraNuklease

Instrumen yang berlaku

Perangkat Molekuler: Seri M dan i

Aplikasi

Deteksi residu Nuklease dalam proses pemurnian terapi sel dan gen serta vaksin virus adeno-associated rekombinan

Data produk:

Kurva standar kit reagen:

Kekhususan

Reaksi silang antara antibodi Salt Active UltraNuclease dan tujuh protein dalam kit dievaluasi dengan menggunakan kit ini untuk mendeteksi protein yang ditambahkan dalam tujuh proses. Kontrol positif (PC-0,047 ng/mL) dan kontrol negatif (NC-0 ng/mL) disiapkan.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa protein yang ditambahkan pada 7 proses mendekati kontrol negatif (NC-0 ng/mL), konsentrasi deteksi lebih rendah dari batas kuantitasi kit ini (0,047 ng/mL), dan tidak terjadi reaksi silang. diamati.

STingkat pemulihan tombak:

Tambahkan tiga standar konsentrasi (yaitu, Std1 3 ng/mL, Std3 0,75 ng/mL, dan Std5 0,188 ng/mL) dalam proporsi yang sama ke dua sampel yang diberikan oleh pelanggan untuk percobaan pemulihan spike. Hasilnya menunjukkan bahwa tingkat pemulihan spike semuanya antara 80% dan 120%. Tingkat pemulihan spike % = (nilai terukur dari sampel yang diberi spike - nilai terukur dari sampel yang tidak diberi spike) / nilai teoritis (jumlah standar yang ditambahkan) * 100%.

Nama sampel

Konsentrasi uji Salt Active UltraNuclease (ng/mL)

Jumlah standar (ng/mL)

Hasil uji (ng/mL)

Tingkat pemulihan lonjakan (%)

Bahasa Indonesia: TS1

0,04

3

1.71

114,00%

0,75

0.347

92,53%

0.188

0,085

90,43%

Bahasa Indonesia: TS2

0,08

3

1.772

118,13%

0,75

0.405

108,00%

0.188

0,104 tahun

110,64%

Ketepatan

1) Pengulangan

Tiga produk standar Salt Active UltraNuclease dengan konsentrasi tinggi, sedang, dan rendah dipilih untuk percobaan berulang. Dalam percobaan yang sama, sampel dari setiap konsentrasi diuji sebanyak 10 kali, dan CV%< 10%.

Perbedaan dalam batch

Konsentrasi teoritis (ng/mL)

Jumlah pengulangan

Rata-rata (ng/mL)

Koefisien Variasi CV (%)

1.5

10

1.444

2,97%

0.188

10

0.196

2,27%

0,047 tahun

10

0,051 tahun

2,56%

2) Presisi Menengah

Batch kit yang berbeda digunakan untuk 3 percobaan, setiap percobaan dilakukan dengan 3 konsentrasi tinggi, sedang, dan rendah, dan setiap konsentrasi diulang 10 kali. Sebanyak 30 data diperoleh dari setiap titik konsentrasi, dan CV% dari setiap konsentrasi kurang dari 15%.

Perbedaan batch

Konsentrasi teoritis (ng/mL)

Jumlah percobaan

Rata-rata (ng/mL)

Koefisien Variasi CV (%)

1.5

3

1.423

5,70%

0.188

3

0.212

5,59%

0,047 tahun

3

0,059

6,82%

Informasi Produk

Nama Produk

Produk nomor

Spesifikasi Produk

Garam Aktif UltraNuclease GMP-grade

Tahun 20159ES25/50/60/80/90

25KU/50KU/100KU/1MU/5MU

Kit ELISA UltraNuclease Aktif Garam

36703ES96

96T

Produk terkait lainnya

Nama Produk

Nomor produk

Spesifikasi Produk

UCF.ME®UltraNuclease kelas GMP (Benzonase)

Tahun 20157ES25/50/60/80/90

25KU/50KU/100KU/1MU/5MU

Kit ELISA UCF.ME® UltraNuclease

36701ES59

96T

Pertanyaan