L'artrite reumatoide (RA) è una malattia articolare infiammatoria cronica caratterizzata da sinovite persistente, infiammazione sistemica ed erosione di ossa e cartilagine, che può portare in ultima analisi ad anchilosi e deformità articolare. I modelli animali di RA sono ampiamente utilizzati per lo studio della patogenesi e dei metodi terapeutici. Sono stati stabiliti vari modelli animali per lo studio dell'eziologia, della patogenesi, dei fattori influenti e della ricerca di nuovi target terapeutici e la valutazione di nuove terapie.

I modelli animali di RA possono essere ampiamente divisi in due categorie: modelli indotti e transgenici. I modelli indotti comuni includono l'artrite indotta dal collagene (CIA) e l'artrite indotta dall'adiuvante (AA), mentre i modelli di topi transgenici includono modelli transgenici di TNF-α umano, ecc.

L'adiuvante di Freund, inventato da Jules Freund negli anni '40, è un'emulsione di antigene olio in acqua realizzata mescolando una soluzione acquosa di antigene con un agente oleoso e aggiungendo un emulsionante. È l'adiuvante più comunemente utilizzato negli esperimenti sugli animali.

L'adiuvante di Freund è diviso in Adiuvante di Freund completo (CFA) contenente Mycobacterium tuberculosis e Adiuvante di Freund incompleto (IFA) senza Mycobacterium tuberculosis. Sono usati principalmente per indurre modelli di artrite indotta da collagene (CIA) e artrite indotta da adiuvante (AA) nei topi.

Figura 1. Artrite reumatoide umana

Figura 2. Artrite reumatoide del topo

1 Artrite indotta dal collagene (CIA) (solo come riferimento)

1.1 Modello di topo

Il modello CIA è uno dei modelli di topi RA più ampiamente utilizzati. L'immunizzazione degli animali con collagene eterologo di tipo II può indurre una risposta autoimmune contro il collagene di tipo II nella cartilagine articolare, con manifestazioni cliniche di artrite periferica poliarticolare.

Metodo di costruzione del modello: il collagene bovino di tipo II (CII) viene sciolto in acido acetico glaciale a 4 °C durante la notte. Quindi, il Mycobacterium tuberculosis (BCG) ucciso dal calore viene posto in paraffina liquida per preparare l'adiuvante di Freund completo (CFA). I ​​due vengono miscelati ed emulsionati per preparare un'emulsione di collagene di tipo II. Questa emulsione viene iniettata sottocutaneamente alla base della coda del topo a 0,1-0,2 mL per indurre l'infiammazione. Il 21° giorno dopo l'immunizzazione iniziale, viene somministrata per via intraperitoneale un'iniezione di richiamo di 0,1-0,2 mL di emulsione di collagene di tipo II. Dopo la prima immunizzazione, i topi avranno reazioni infiammatorie locali che guariranno entro circa una settimana; dopo l'adiuvante, i topi svilupperanno gonfiore alle articolazioni a partire dal giorno 24, progredendo dalle zampe posteriori a quelle anteriori e poi alla coda.

1.2 Modello di ratto

Metodo di costruzione del modello: il collagene bovino di tipo II (CII) viene miscelato con l'adiuvante di Freund incompleto (IFA) in volumi uguali ed emulsionato. Il primo giorno, i ratti vengono iniettati per via intradermica in più siti e una settimana dopo ricevono una spinta intraperitoneale. Il modello viene ottenuto entro 3-7 giorni dalla seconda immunizzazione. Sette giorni dopo la sensibilizzazione, le articolazioni della caviglia saranno leggermente gonfie e rosse e i sintomi peggioreranno dopo 3 settimane, con possibile ulcerazione cutanea; dopo 5-6 settimane, i cambiamenti patologici peggiorano ulteriormente, con la cartilagine articolare e l'osso subcondrale erosi e distrutti dal panno.

2 Artrite indotta da adiuvanti (AA) (solo a scopo di riferimento)

Il modello AA è il modello di AR nei ratti più ampiamente utilizzato, con due tipi: adiuvante di Freund incompleto (IFA) e adiuvante di Freund completo (CFA).

Metodo di costruzione del modello: ai ratti viene iniettata per via intradermica una sostanza per indurre l'infiammazione.Il modello mostra generalmente sintomi infiammatori continui 10-20 giorni dopo l'induzione, con un picco intorno ai 20 giorni. L'infiammazione è principalmente nell'articolazione della caviglia, che può interessare il cuscinetto plantare e l'intero piede. I sintomi di gonfiore articolare sono simili a quelli dei pazienti con AR clinica, ma possono verificarsi fenomeni di disfunzione immunitaria.

3 passaggi di modellazione dell'artrite indotta dal collagene (CIA) (solo come riferimento)

• Il collagene bovino di tipo II (CII) viene sciolto in una soluzione di acido acetico glaciale a una concentrazione di 2 mg/mL e conservato durante la notte a 4°C.
• L'adiuvante di Freund incompleto è integrato con Mycobacterium tuberculosis ucciso termicamente a una concentrazione di 2-5 mg/mL. La concentrazione di Mycobacterium tuberculosis nell'adiuvante di Freund completo 60718ES fornito da Yisheng Biology è inferiore a 10 mg/mL.
• La soluzione di acido acetico di collagene bovino di tipo II viene miscelata con l'adiuvante completo di Freund in volumi uguali ed emulsionata.
• A ciascun topo sperimentale vengono somministrate 4-6 iniezioni sottocutanee sulla schiena, per un totale di 0,1-0,2 mL.
• Tre settimane dopo, l'adiuvante di Freund incompleto viene miscelato con una soluzione di acido acetico di collagene bovino di tipo II in volumi uguali ed emulsionato, e a ciascun topo vengono somministrate 3-5 iniezioni sottocutanee alla base della coda, per un totale di 0,1-0,2 mL.

4 passaggi di modellazione dell'artrite indotta da adiuvanti (AA) (solo a scopo di riferimento)

• Preparare i reagenti appropriati, tenendo conto dell'impostazione dei gruppi sperimentali e di controllo.
• Osservazione e registrazione: in genere, oltre l'80% dei topi mostra sintomi di artrite 7-12 giorni dopo la seconda immunizzazione. I sintomi clinici sono classificati in base al rossore e all'attività dell'articolazione del topo e le osservazioni sono registrate prima dell'esperimento e il 3°, 5°, 7° e 12° giorno dopo l'esperimento, con criteri di classificazione come segue:

Tabella 1 Criteri di punteggio

Snucleo	Ssintomo
0	L'attività era normale, senza segni di eritema e gonfiore.
1	L'attività era normale, si riscontrava solo un arrossamento della pelle e nessun gonfiore significativo.
2	L'attività è leggermente compromessa, gli artigli, i cuscinetti plantari o l'articolazione del ginocchio sono arrossati.
3	Attività compromessa, dita e articolazioni delle zampe leggermente deformate e gonfie.
4	I movimenti sono bloccati, le dita dei piedi e le articolazioni sono gravemente rosse e gonfie, rigide o deformi.

• Misurazione del topo: utilizzare un misuratore del volume della zampa del topo per misurare il volume dell'articolazione dell'arto posteriore del topo prima e dopo l'esperimento. Misurare il volume di circa 5 mm sotto l'articolazione del ginocchio di ogni zampa posteriore del topo tre volte, registrare il valore medio e il volume è proporzionale al grado di rossore e gonfiore dell'articolazione. Il rilevamento viene eseguito ogni tre giorni.
• Esame patologico: prelevare i topi dai gruppi sperimentali e di controllo, rimuovere la pelle, fissare con formaldeide al 4% per più di 48 ore, decalcificare con acido nitrico al 5% per 2 ore, immergere in xilene e includere in paraffina. Realizzare sezioni da 6 mm, colorare con HE e osservare con un microscopio ottico convenzionale per stabilire uno standard di punteggio per la diagnosi patologica.

5 Immagini di casi sperimentali (estratte dalla letteratura)