Diabete mellito (DM), una malattia metabolica cronica sistemica caratterizzata da un aumento cronico della glicemia causato da una combinazione di molteplici fattori di malattia, è un'epidemia sanitaria globale e correlata alla genetica familiare, a fattori ambientali, e autoimmunità. Sebbene il DM sia noto da millenni e siano stati compiuti grandi progressi nella sua diagnosi e gestione, attualmente non esiste una cura per la malattia e le sue conseguenze sulla salute pubblica sono in crescita. Pertanto, è particolarmente importante stabilire un modello animale appropriato del DM e chiarire la patogenesi del DM e le sue complicazioni. I modelli animali del DM comunemente utilizzati sono la resezione chirurgica del pancreas, il diabete indotto chimicamente, il modello animale del diabete spontaneo e gli animali transgenici, ecc.
Attualmente, il modello di malattia del diabete indotto da Streptozotocina (STZ) è ampiamente utilizzato, adatto per l'osservazione a lungo termine. STZ è un composto nitrosoureico che, una volta all'interno del corpo, può distruggere specificamente le cellule β pancreatiche attraverso i seguenti meccanismi:
(1) L'iniezione di STZ ad alto dosaggio può causare una diminuzione della concentrazione del coenzima I intracellulare (NAD) nelle cellule β e quindi inibire il metabolismo energetico e proteico dipendente dal NAD, con conseguente morte cellulare;
(2) STZ aumenta l'ossido nitrico (NO) produzione, che ha dimostrato di partecipare al danno delle cellule β;
(3) Somministrato a basse dosi, STZ può innescare un processo autoimmune che porta alla distruzione delle cellule β delle isole pancreatiche: le cellule β morte, a causa di una bassa dose di STZ, possono essere fagocitate dai macrofagi come antigeni per produrre il fattore stimolante Th1, rendendo dominanti i linfociti di tipo Th1. Quindi i linfociti di tipo Th1 producono IL-2 e IFN-γ, causando l'infiltrazione di cellule infiammatorie nell'isolotto e il rilascio di IL-1 e TNF-α, IFN-γ, NO e H2Lo2 per uccidere le cellule, inducendo infine il diabete mellito.
Biotecnologia Yeasen fornisce un alto tasso di successo STZ (Cat#60256ES) per la modellazione: elevata purezza ≥ 98% (HPLC).
1 Procedura standard per la costruzione del modello di diabete indotto da STZ
1.1 Preparazione degli animali
C'è un marcato dimorfismo sessuale e i maschi sono più suscettibili a sviluppare il diabete. Poiché l'estrogeno interferisce con l'azione di STZ, le femmine sono meno sensibili all'azione diabetogena di STZ rispetto ai maschi. Gli studi hanno dimostrato che le femmine hanno un tasso di modellazione scarso e un tasso di mortalità più elevato rispetto ai maschi, in particolare di tipo I.
Diabete di tipo I (T1DM): Ratti (170-200 g) e topi (17-22 g) sono raccomandati. Dopo una settimana di alimentazione adattativa, animali digiuni per 12 ore seguite da iniezione intraperitoneale di STZ, che può essere facilmente eseguita e con un alto tasso di successo.
Diabete di tipo II (T2DM): I ratti (età 4-5 settimane, peso 90-100 g, ad esempio SD o Wistar) e i topi (età 4-5 settimane, peso 16-20 g, ad esempio C57, ICR o Kunming) devono essere alimentati con una dieta ricca di grassi e zuccheri per 4-6 settimane prima della somministrazione di STZ e il peso corporeo può raggiungere individualmente circa 240-280 g e 30-35 g. SD è raccomandato per i ratti e C57 per i topi.
1.2 Alimentazione degli animali prima della somministrazione di STZ
Diabete di tipo 1: Consentire a tutti i topi e ratti di accedere liberamente alla dieta standard per roditori e di bere acqua per 1-2 settimane di alimentazione adattativa prima del trattamento con STZ.
Diabete di tipo 2: Consumare una dieta ricca di grassi e zuccheri per rendere l'insulina resistente prima del trattamento con STZ.
1.3 Preparazione del reagente
① Dieta ricca di grassi e zuccheri
La dieta ricca di grassi e zuccheri è preparata mescolando mangime base per ratti con saccarosio, grasso di maiale raffinato e tuorlo d'uovo in polvere in un rapporto di massa: le proporzioni sono 10% grasso di maiale, 20% saccarosio, 10% tuorlo d'uovo in polvere, 0,5% colato di sodio e 59,5% mangime base.
② Tampone STZ-citrato di sodio
Preparazione della soluzione A e della soluzione B: pesare 2,1 g di acido citrico (PM: 210,14) e scioglierlo in 100 mL di acqua bidistillata per ottenere la soluzione A; pesare 2,94 g di citrato di sodio (PM: 294,10) e scioglierlo in 100 mL di acqua bidistillata per ottenere la soluzione B.
Preparazione del tampone di citrato di sodio: mescolare le soluzioni A e B in un certo rapporto (1:1,32 o 1:1), regolare il pH a 4,2-4,5 e filtrare e sterilizzare utilizzando una membrana filtrante da 0,22 μm. Questo produce il tampone di citrato di sodio richiesto; si consiglia di prepararlo e utilizzarlo immediatamente.
Pesare la polvere liofilizzata STZ, metterla in una bottiglia asciutta e sterile, avvolgerla con un foglio di alluminio e metterla su ghiaccio. Aggiungere tampone di citrato di sodio preraffreddato (1% p/v) per scioglierlo e filtrare e sterilizzare utilizzando una membrana filtrante da 0,22 μm.
【Nota】① Dopo aver estratto la polvere STZ dal frigorifero, conservarla a temperatura ambiente e al riparo dalla luce per circa 10 minuti fino al completo scongelamento. ② Dopo la pesatura, la bottiglia contenente il campione di STZ deve essere coperta con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce, poiché STZ è instabile. ③ Non sciogliere STZ in una volta se non si è esperti nell'iniezione. Si consiglia di sciogliere STZ in gruppi in base alla competenza operativa. Preparare la soluzione STZ per un gruppo alla volta, ad esempio 10 o 15 ratti/topi per gruppo.
1.4 Iniezione STZ
Somministrare l'iniezione per via intraperitoneale o tramite la vena della coda in base al peso a digiuno dell'animale. Rispetto all'iniezione intraperitoneale, l'iniezione nella vena della coda ha una maggiore efficienza di utilizzo del farmaco ma è più impegnativa dal punto di vista tecnico. Se la tecnica di iniezione non è competente, alternare tra due gruppi per l'iniezione e l'iniezione deve essere completata entro 30 minuti.
Diabete di tipo 1: Nei topi si raccomanda una dose singola elevata pari a 100-200 mg/kg e dosi multiple basse pari a 20-50 mg/kg per cinque giorni consecutivi; nei ratti si suggerisce una dose pari a 40-70 mg/kg, somministrata in un'unica iniezione.
Diabete di tipo 2:Dopo una dieta ricca di zuccheri e grassi per 1-2 mesi, nei topi si raccomanda una dose di 70-120 mg/kg, somministrata in un'unica iniezione; nei ratti, la dose suggerita è di 25-40 mg/kg, somministrata in un'unica iniezione.
【Nota】Si raccomanda di condurre un pre-esperimento per determinare il dosaggio appropriato di STZ, a causa del diverso peso, tolleranza al farmaco, tempo di digiuno, metodo di iniezione e processo di alimentazione degli animali da esperimento. Non eseguire ciecamente l'esperimento direttamente in base al dosaggio in letteratura.
1.5 Post-iniezione
Dopo l'iniezione di STZ, lasciare gli animali liberi di bere e mangiare. Cambiare l'imbottitura ogni giorno. Mantenere la gabbia pulita e asciutta. Evitare la luce solare intensa. Disinfettare il più spesso possibile.
【Nota】Dopo l'iniezione di STZ, il livello di glucosio nel sangue degli animali mostrerà tre fasi: iperglicemia transitoria (1-2 ore), ipoglicemia transitoria (6-10 ore) e iperglicemia continua (>72 ore). Insulina e glucosio devono essere forniti correttamente.
1.6 Rimedio della modellazione animale
Per i modelli che non soddisfano i criteri, STZ può essere somministrato in aggiunta una volta che l'animale si è stabilizzato (con un'iniezione intraperitoneale a una dose di 10-20 mg/kg, scegliendo una dose appropriata in base alla situazione effettiva), oppure attendere che i livelli di glucosio nel sangue tornino alla normalità e quindi iniettare alla dose di routine. Tuttavia, per ottenere l'effetto desiderato, è spesso necessario riavviare il processo di modellazione dopo il ritorno a uno stato normale.
2 Valutazione di DM indotto da STZ modelli animali
① Caratteristiche generali: perdita di peso corporeo, polidipsia, polifagia e poliuria.
② Glicemia a digiuno (FGB), livello di insulina sierica (FINS), tolleranza al glucosio orale (OGT), insulina sierica a digiuno (FSI) e sensibilità all'insulina.
③ Indici biochimici sierici: T-Cho、TG、HDL-C、LDL-C、CR、BUN、Alt, ecc.
④ Patologia del pancreas: colorazione con H&E.
3 Possibili ragioni del fallimento del modello DM indotto da STZ
① Scarsa qualità di STZ. La purezza di STZ per la modellazione non deve essere inferiore al 98% (rilevamento HPLC).
② Degradazione STZ. STZ è una soluzione facile da inumidire, dovrebbe essere tenuta asciutta, per evitare l'umidità. La polvere evita un lungo posizionamento a temperatura ambiente, e lo STZ disciolto è molto instabile, con un'emivita di pH neutro di 15 min, e dovrebbe essere utilizzato in loco. Si prega di sciogliere lo STZ con un valore di pH acido, preferibilmente in un bagno di ghiaccio.
③ La soluzione STZ veniva iniettata nell'intestino o in altri organi.
Se il modello non supera lo standard DM, si raccomanda di osservare per altri 3 giorni. Se non supera ancora, ripetere la procedura di iniezione.
4 Le cause dell'elevata mortalità degli animali indotta da STZ
① Gli animali sono sottopeso.
② Fornitura insufficiente di acqua potabile.
③ Iperglicemia o ipoglicemia, solitamente iperglicemia. Questo può essere alleviato da iniezione di insulina o integrazione temporanea di glucosio.
Metodo di integrazione di insulina: ad esempio, se si somministra Novolin N o NPH (insulina protamina-zinco neutra) per 2-3 unità ogni volta, la mortalità generale dei ratti sarà inferiore dopo 3-5 giorni.
Metodo di integrazione di glucosio: l'iniezione intraperitoneale di glucosio al 20% 4 ore dopo l'iniezione di STZ può evitare la morte dei ratti dovuta a bassi livelli di glucosio nel sangue causati dal digiuno.
④ Gli animali da esperimento si uccidono a vicenda a causa della mancanza di cibo e acqua.
⑤ Infezione. Gli animali DM sono più inclini alle infezioni rispetto ad altri, in particolare alle infezioni del tratto urinario e alle infezioni addominali, a causa della poliuria. È necessario disinfettare prima e dopo operazioni invasive come iniezione intraperitoneale, iniezione sottocutanea e prelievo di sangue. Ad esempio, la tetraciclina (o unguento oftalmico all'aureomicina) può essere applicata alla ferita dopo ogni misurazione della glicemia per prevenire le infezioni.
5 fattori che influenzano la modellazione del diabete
I fattori che influenzano il modello di malattia del diabete includono la qualità del reagente di modellazione STZ, le condizioni degli animali e il metodo di somministrazione. Le principali caratteristiche di prestazione del reagente includono purezza, stabilità e solubilità. Le condizioni degli animali includono principalmente background genetico, sesso, genere, peso, ambiente di riproduzione e struttura dietetica. I metodi di somministrazione includono tempi di somministrazione, intervalli tra le dosi e vie di somministrazione. Fattori differenziati determinano effetti di modellazione differenziati.
6 Prodotto Rraccomandazione
| Nome del prodotto | Gatto# | Specificazione |
| 60256ES60 | 100mg | |
| 60256ES76 | 500 mg | |
| 60256ES80 | 1 grammo | |
| Acido citrico, Monoidrato | 60347ES25 | 25 grammi |
| Sale trisodico dell'acido citrico, Diidrato | 60348ES25 | 25 grammi |
| Solvente per Streptozocina STZ | 60750ES76 | 500 ml |
[1] Xi Z, et al. Le nanoparticelle a doppia modifica superano le barriere dell'assorbimento sequenziale per la somministrazione orale di insulina. J Control Release. Febbraio 2022;342:1-13. (PMID: 34864116, SE:7.727)