Che cosa è l'Aureobasidina A?

L'aureobasidina A (AbA) è un antibiotico peptidico ciclico isolato dal fungo filamentoso Aureobasidium pullulans n. R106, che ha forti proprietà antimicotiche e può essere tossico per il lievito a basse concentrazioni (0,1-0,5 μg/mL). Il meccanismo d'azione dell'AbA avviene attraverso l'inibizione dell'attività dell'inositolo fosforilceramide sintasi (IPC sintasi), un enzima codificato dal gene AUR1 nel lievito, che blocca la sintesi da ceramide a fosfolipidi di inositolo, portando a una carenza di sfingolipidi, rottura della membrana cellulare e quindi uccisione del ceppo. Le specie fungine sensibili all'AbA includono Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans e A. niger.

Figura 1 Formula strutturale di AbA, CAS#127785-64-2

La ricerca ha scoperto che il gene AUR1 di Saccharomyces cerevisiae e il gene AURA di Aspergillus nidulans sono omologhi, entrambi codificanti per la sintasi IPC. Pertanto, le mutazioni in questi due geni possono conferire una forte resistenza ad AbA a ceppi, come il gene mutato AUR1-C. AbA è molto adatto come marcatore di selezione di farmaci per lo screening di cloni positivi e non richiede l'ottimizzazione delle condizioni, con uno sfondo molto basso. La resistenza ad AbA è anche un reporter ideale per studi di ibridi singoli/doppi di lievito ed è compatibile con sistemi ibridi di lievito che trasportano una resistenza corrispondente.

Che cosa è il sistema ibrido singolo/doppio del lievito?

Il sistema a due ibridi di lievito (Yeast two-hybrid assay) è stato creato da Fields e Song e altri sulla base delle caratteristiche della regolazione trascrizionale eucariotica. Può analizzare rapidamente e direttamente le interazioni tra proteine ​​note ed è ampiamente utilizzato nello studio delle interazioni antigene-anticorpo, nella scoperta di nuove proteine ​​e nuove funzioni proteiche, nello screening di bersagli farmacologici e nella creazione di mappe di collegamento proteico genomiche. Il principio del lievito a due ibridi è che l'attivatore trascrizionale degli eucarioti contiene due diversi domini strutturali: il dominio di legame al DNA (DNA binding domain, DNA-BD) e il dominio di attivazione della trascrizione del DNA (Activation domain, AD), che possono essere separati indipendentemente senza influenzare la funzione reciproca. BD e AD da soli non possono attivare la risposta trascrizionale, solo quando i due sono abbastanza vicini spazialmente, mostrano l'attività di un attivatore trascrizionale completo, consentendo la trascrizione del gene a valle. Costruendo plasmidi di fusione delle due proteine ​​in studio (proteina X e proteina Y) rispettivamente con i domini BD e AD ed esprimendoli nella stessa cellula di lievito, se non c'è interazione tra le due proteine, il gene reporter non verrà trascritto; se le due proteine ​​interagiscono, i domini BD e AD saranno spazialmente vicini, quindi il gene reporter verrà trascritto.

Figura 2 Diagramma di principio del lievito a due ibridi [1]

La tecnologia Yeast one-hybrid è uno strumento per studiare le interazioni tra acidi nucleici e proteine, sviluppato sulla base del lievito two-hybrid, ed è ampiamente utilizzato per studiare la regolazione dell'espressione dei geni nelle cellule eucariotiche, come l'identificazione di un'interazione tra DNA noto e proteine ​​note; l'isolamento di nuove proteine ​​che si legano all'elemento cis-regolatore bersaglio o ad altri siti di legame del DNA corti; l'individuazione accurata dei siti di legame del DNA che hanno dimostrato di interagire e l'analisi dei domini di legame del DNA delle proteine. Il suo principio di base è quello di costruire l'elemento cis-agente noto a monte del promotore più elementare (promotore minimo, Pmin) e collegare il gene reporter a valle di Pmin. Il cDNA che codifica il fattore di trascrizione da testare viene fuso con il vettore di espressione del dominio AD del lievito e introdotto nelle cellule di lievito.Se il prodotto di questo gene riesce a legarsi all'elemento cis-agente, può attivare il promotore Pmin, consentendo l'espressione del gene reporter.

Figura 3 Diagramma di principio del lievito mono-ibrido [2]

Per gli studi sugli ibridi singoli/doppi di lievito, Yeasen offre prodotti 60231ES Aureobasidina A (AbA), una soluzione di AbA disciolta in metanolo con una purezza ≥ 97% e una concentrazione di 1 mg/mL. Yeasen raccomanda una concentrazione inibitoria di AbA di 100-1000 ng/mL negli esperimenti di ibridi singoli/doppi di lievito, e la concentrazione di lavoro specifica dipende dalla sensibilità delle cellule ospiti (vedere la seguente tabella, Concentrazioni inibitorie minime (MIC) di AbA per vari ceppi di lievito).

Bsforzo atriale

Microfono (Ng/ml)

S.cerevisiae

ATCC9763 (diploide)

200-400

SH3328 (aploide)

100

Lievito di sake (diploide)

100-200

Lievito di shochu (diploide)

100

Lievito di birra (triploide o tetraploide)

100

Lievito di birra (diploide)

200-400

Schizo.pombe

Il JY-745 (monoploide)

100

C.albicans

Codice articolo: TIMM-0136 (diploide)

40

C.tropicalis

TIMM-0324 (diploide)

80

Caso di applicazione

Per studiare il sito di legame della proteina GmWRKY31 sul promotore del gene GmSAGT1, nell'esperimento di lievito con un ibrido, la sequenza di DNA target è stata inserita nel vettore pBait-AbAi contenente il gene reporter dell'uracile Ura3, situato a monte del gene AUR1-C. Dopo la trasformazione del lievito con il plasmide corrispondente, è stato sospeso in una soluzione di NaCl allo 0,9% e l'OD600 è stato regolato a 0,005. Successivamente, 100 μL del campione sono stati distribuiti su piastre contenenti 500 ng/mL di AbA, capovolti e coltivati ​​a 30℃ per 3-5 giorni[3].

Figura 3 Interazione della proteina GmWRKY31 con ceppi di lievito contenenti frammenti F16, F20, F73, delF16, delF20 o delF73.

Articoli pubblicati con i nostri reagenti

[1] Shunan Zhang, Yuyi Zhang, Kangning Li,, et al. L'azoto media il tempo di fioritura e l'efficienza dell'uso dell'azoto tramite regolatori floreali nel riso, Current Biology, Volume 31, Numero 4, 2021, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (SE:10.834)

[2] Jiaying Kuang, Yingchun Xu, Yidan Liu, et al. Una rete regolatrice centrata su NnSnRK1 per la cessazione precoce della fioritura indotta dall'ombra nel loto, Botanica ambientale e sperimentale, Volume 221,2024,105725, https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725. (SE:5.7)

Prodotti correlati

Nome del prodotto

Gatto#

Specificazione

Ciprofloxacina cloridrato

60201ES05/25/60

5/25/100g

Ampicillina, sale di sodio

60203ES10/60

10/100g

Doxiciclina iclato

60204ES03/08/25

1/5/25g

Cloramfenicolo, grado USP

60205ES08/25/60

5/25/100g

Solfato di kanamicina

60206ES10/60

10/100g

Tetraciclina HCl Tetraciclina cloridrato (USP)

60212ES25/60

25/100g

Vancomicina cloridrato

60213ES60/80/90

100 mg/1 g/5 g

Sale di solfato di gentamicina

60214ES03/08/25

1/5/25g

Cloridrato di spectinomicina

60215ES08

5g

Fleomicina (20 mg/mL in soluzione)

60217ES20/60

20/5×20mg

Blasticidina S (Blasticidina)

60218ES10/60

10/10×10mg

Nistatina

60219ES08

5g

Solfato G418 (Geneticina)

60220ES03/08

1/5g

Puromicina (soluzione 10 mg/mL)

60209ES10/50/60/76

1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 mL

Puromicina diidrocloruro

60210ES25/60/72/76/80

25/100/250/500 mg / 1 g

Igromicina B (50 mg/mL)

60224ES03

1 g (20 ml)/10×1 g (20 ml)

Igromicina B

60225ES03/10

1/10g

Eritromicina

60228ES08/25

5/25g

Temporina

60230ES07/32

Formato 3,2/10×3.2g

Aureobasidina A (AbA)

60231ES03/08/10

1/5×1/10×1mg

Solfato di polimixina B

60242ES03/10

1/10 MU

Documentazione di riferimento

[1] Paiano A, et al. Saggio del lievito a due ibridi per identificare le proteine ​​interagenti.Curr Protoc Protein Sci. 2019 febbraio;95(1):e70.

[2] John S, et al. Saggi di un ibrido di lievito: una prospettiva storica e tecnica. Metodi. 2012 agosto; 57 (4): 441-447.

[3] Dong H, et al. Analisi del trascrittoma dei TF WRKY della soia in risposta all'infezione da Peronospora manshurica. Genomica. 2019 dicembre;111(6):1412-1422.

Indagine