Che cosa è l'Aureobasidina A?
L'aureobasidina A (AbA) è un antibiotico peptidico ciclico isolato dal fungo filamentoso Aureobasidium pullulans n. R106, che ha forti proprietà antimicotiche e può essere tossico per il lievito a basse concentrazioni (0,1-0,5 μg/mL). Il meccanismo d'azione dell'AbA avviene attraverso l'inibizione dell'attività dell'inositolo fosforilceramide sintasi (IPC sintasi), un enzima codificato dal gene AUR1 nel lievito, che blocca la sintesi da ceramide a fosfolipidi di inositolo, portando a una carenza di sfingolipidi, rottura della membrana cellulare e quindi uccisione del ceppo. Le specie fungine sensibili all'AbA includono Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans e A. niger.
Figura 1 Formula strutturale di AbA, CAS#127785-64-2
La ricerca ha scoperto che il gene AUR1 di Saccharomyces cerevisiae e il gene AURA di Aspergillus nidulans sono omologhi, entrambi codificanti per la sintasi IPC. Pertanto, le mutazioni in questi due geni possono conferire una forte resistenza ad AbA a ceppi, come il gene mutato AUR1-C. AbA è molto adatto come marcatore di selezione di farmaci per lo screening di cloni positivi e non richiede l'ottimizzazione delle condizioni, con uno sfondo molto basso. La resistenza ad AbA è anche un reporter ideale per studi di ibridi singoli/doppi di lievito ed è compatibile con sistemi ibridi di lievito che trasportano una resistenza corrispondente.
Che cosa è il sistema ibrido singolo/doppio del lievito?
Il sistema a due ibridi di lievito (Yeast two-hybrid assay) è stato creato da Fields e Song e altri sulla base delle caratteristiche della regolazione trascrizionale eucariotica. Può analizzare rapidamente e direttamente le interazioni tra proteine note ed è ampiamente utilizzato nello studio delle interazioni antigene-anticorpo, nella scoperta di nuove proteine e nuove funzioni proteiche, nello screening di bersagli farmacologici e nella creazione di mappe di collegamento proteico genomiche. Il principio del lievito a due ibridi è che l'attivatore trascrizionale degli eucarioti contiene due diversi domini strutturali: il dominio di legame al DNA (DNA binding domain, DNA-BD) e il dominio di attivazione della trascrizione del DNA (Activation domain, AD), che possono essere separati indipendentemente senza influenzare la funzione reciproca. BD e AD da soli non possono attivare la risposta trascrizionale, solo quando i due sono abbastanza vicini spazialmente, mostrano l'attività di un attivatore trascrizionale completo, consentendo la trascrizione del gene a valle. Costruendo plasmidi di fusione delle due proteine in studio (proteina X e proteina Y) rispettivamente con i domini BD e AD ed esprimendoli nella stessa cellula di lievito, se non c'è interazione tra le due proteine, il gene reporter non verrà trascritto; se le due proteine interagiscono, i domini BD e AD saranno spazialmente vicini, quindi il gene reporter verrà trascritto.
Figura 2 Diagramma di principio del lievito a due ibridi [1]
La tecnologia Yeast one-hybrid è uno strumento per studiare le interazioni tra acidi nucleici e proteine, sviluppato sulla base del lievito two-hybrid, ed è ampiamente utilizzato per studiare la regolazione dell'espressione dei geni nelle cellule eucariotiche, come l'identificazione di un'interazione tra DNA noto e proteine note; l'isolamento di nuove proteine che si legano all'elemento cis-regolatore bersaglio o ad altri siti di legame del DNA corti; l'individuazione accurata dei siti di legame del DNA che hanno dimostrato di interagire e l'analisi dei domini di legame del DNA delle proteine. Il suo principio di base è quello di costruire l'elemento cis-agente noto a monte del promotore più elementare (promotore minimo, Pmin) e collegare il gene reporter a valle di Pmin. Il cDNA che codifica il fattore di trascrizione da testare viene fuso con il vettore di espressione del dominio AD del lievito e introdotto nelle cellule di lievito.Se il prodotto di questo gene riesce a legarsi all'elemento cis-agente, può attivare il promotore Pmin, consentendo l'espressione del gene reporter.
Figura 3 Diagramma di principio del lievito mono-ibrido [2]
Per gli studi sugli ibridi singoli/doppi di lievito, Yeasen offre prodotti 60231ES Aureobasidina A (AbA), una soluzione di AbA disciolta in metanolo con una purezza ≥ 97% e una concentrazione di 1 mg/mL. Yeasen raccomanda una concentrazione inibitoria di AbA di 100-1000 ng/mL negli esperimenti di ibridi singoli/doppi di lievito, e la concentrazione di lavoro specifica dipende dalla sensibilità delle cellule ospiti (vedere la seguente tabella, Concentrazioni inibitorie minime (MIC) di AbA per vari ceppi di lievito).
| Bsforzo atriale | Microfono (Ng/ml) | |
| S.cerevisiae | ATCC9763 (diploide) | 200-400 |
| SH3328 (aploide) | 100 | |
| Lievito di sake (diploide) | 100-200 | |
| Lievito di shochu (diploide) | 100 | |
| Lievito di birra (triploide o tetraploide) | 100 | |
| Lievito di birra (diploide) | 200-400 | |
| Schizo.pombe | Il JY-745 (monoploide) | 100 |
| C.albicans | Codice articolo: TIMM-0136 (diploide) | 40 |
| C.tropicalis | TIMM-0324 (diploide) | 80 |
Caso di applicazione
Per studiare il sito di legame della proteina GmWRKY31 sul promotore del gene GmSAGT1, nell'esperimento di lievito con un ibrido, la sequenza di DNA target è stata inserita nel vettore pBait-AbAi contenente il gene reporter dell'uracile Ura3, situato a monte del gene AUR1-C. Dopo la trasformazione del lievito con il plasmide corrispondente, è stato sospeso in una soluzione di NaCl allo 0,9% e l'OD600 è stato regolato a 0,005. Successivamente, 100 μL del campione sono stati distribuiti su piastre contenenti 500 ng/mL di AbA, capovolti e coltivati a 30℃ per 3-5 giorni[3].
Figura 3 Interazione della proteina GmWRKY31 con ceppi di lievito contenenti frammenti F16, F20, F73, delF16, delF20 o delF73.
Articoli pubblicati con i nostri reagenti
[1] Shunan Zhang, Yuyi Zhang, Kangning Li,, et al. L'azoto media il tempo di fioritura e l'efficienza dell'uso dell'azoto tramite regolatori floreali nel riso, Current Biology, Volume 31, Numero 4, 2021, https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.10.095. (SE:10.834)
[2] Jiaying Kuang, Yingchun Xu, Yidan Liu, et al. Una rete regolatrice centrata su NnSnRK1 per la cessazione precoce della fioritura indotta dall'ombra nel loto, Botanica ambientale e sperimentale, Volume 221,2024,105725, https://doi.org/10.1016/j.envexpbot.2024.105725. (SE:5.7)
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Documentazione di riferimento
[1] Paiano A, et al. Saggio del lievito a due ibridi per identificare le proteine interagenti.Curr Protoc Protein Sci. 2019 febbraio;95(1):e70.
[2] John S, et al. Saggi di un ibrido di lievito: una prospettiva storica e tecnica. Metodi. 2012 agosto; 57 (4): 441-447.
[3] Dong H, et al. Analisi del trascrittoma dei TF WRKY della soia in risposta all'infezione da Peronospora manshurica. Genomica. 2019 dicembre;111(6):1412-1422.