1 UNprincipio di azione
L'igromicina B è un antibiotico aminoglicosidico prodotto dal metabolismo dello Streptomyces hygroscopicus, che inibisce la sintesi proteica interrompendo la traslocazione e favorendo l'errata interpretazione dei ribosomi 80S, uccidendo così le cellule procariotiche ed eucariotiche.
Attualmente, viene comunemente utilizzato per esaminare e mantenere cellule procariotiche o eucariotiche contenenti il gene di resistenza all'igromicina.
2 Applicazione
2.1Screening e mantenimento della coltura di cellule procariotiche o eucariotiche (cellule vegetali e cellule di mammifero) stabilmente transfettate con Hph+vettoriL'Igromicina B gene di resistenza (hyg o hph) derivato da Escherichia coli. codifica per l'igromicina B fosfotransferasi, che converte l'igromicina B in un prodotto fosforilato biologicamente inattivo, detossificandolo. Alla luce di questo principio, l'igromicina B è un marcatore selezionabile molto utile per esaminare e mantenere cellule procariotiche o eucariotiche coltivate e trasfettate con successo con il gene di resistenza all'igromicina.
2.2 A causa della differenza nella modalità di azione, l'igromicina B è spesso utilizzata in combinazione con la geneticina G418, la bleomicina e la blasticidina per esaminare linee cellulari stabilmente transfettate con due vettori diversi.L'igromicina B ha una modalità di azione diversa da G418 (Cat#60220ES), Bleomicina (Cat#60257ES) e Blasticidine (Cat#60218ES), quindi è adatto all'uso in combinazione con altri antibiotici selettivi negli esperimenti di doppia selezione.
2.3 Agente antivirale2.4 Come antielmintico, viene aggiunto ai mangimi per animali e gli animali vengono allevati.
2.5 Screening delle cellule transfettate stabilmente
La concentrazione di lavoro di igromicina B utilizzata per lo screening di transfettanti stabili varia a seconda del tipo di cellula, del mezzo, delle condizioni di crescita e del tasso metabolico cellulare. La concentrazione raccomandata è 50-1000 μg/mL. Per il primo utilizzo del sistema sperimentale si raccomanda di determinare la concentrazione di screening ottimale stabilendo una curva di kill, ovvero una curva dose-risposta. In generale, 50-500 μg/mL per cellule di mammiferi; 20-200 μg/mL per cellule di batteri/piante; 200-1000 μg/mL per funghi.
3 Protocollo
3.1 Preparazione della soluzione di conservazione (50 mg/mL)
Pesare 0,5 g di igromicina B e aggiungere 10 mL di 1×PBS, pH 7,4. Dopo la completa dissoluzione, filtrare con un filtro da 0,22 μm per la sterilizzazione. Aliquotare la soluzione sterilizzata e conservare a -20℃.
3.2 Concentrazione di screening comunemente utilizzata
La concentrazione di lavoro dell'igromicina B per lo screening di ceppi stabili varia in base al tipo di cellula, al terreno di coltura, alle condizioni di crescita e al tasso metabolico cellulare. Si raccomanda di stabilire una curva di kill (curva dose-risposta), per determinare la concentrazione di screening ottimale per la prima volta. In genere, cellule di mammifero: 50-500 μg/mL; cellule batteriche/vegetali: 20-200 μg/mL; funghi: 300-1000 μg/mL.
3.3 Stabilimento della curva di uccisione
【Nota】Per selezionare linee cellulari stabili, è necessario determinare la concentrazione minima di antibiotici in grado di uccidere le cellule ospiti non transfettate. Ciò può essere ottenuto stabilendo una curva di uccisione (curva dose-risposta). Devono essere disposte almeno cinque concentrazioni.
1) Giorno 1: le cellule non trasformate vengono disposte in una piastra di coltura adatta a una densità cellulare del 20-25% e coltivate durante la notte.【Nota】La quantità di cellule da inoculare può essere aumentata per le cellule che richiedono una densità maggiore per rilevare la vitalità.
2) Impostare il gradiente di concentrazione entro l'intervallo appropriato in base al tipo di cellula. La cellula di mammifero può impostare 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg/mL. Diluire la soluzione di igromicina B 1:10 con acqua deionizzata o tampone PBS a 5 mg/mL. Quindi diluire la soluzione alla concentrazione di lavoro corrispondente in base alla seguente tabella.
| Concentrazione finale (μg/mL) | Volume medio (mL) | Volume di aggiunta di 5 mg/mL di igromicina B (mL) |
| 50 | 9.9 | 0,1 |
| 100 | 9.8 | 0,2 |
| 250 | 9.5 | 0,5 |
| 500 | 9.0 | 1.0 |
| 750 | 8.5 | 1.5 |
| 1000 | 8.0 | 2.0 |
3) Giorno 2: sostituire con un mezzo appena preparato contenente la concentrazione corrispondente del farmaco. Preparare tre campioni paralleli per ogni concentrazione.
4) Sostituire ogni 3-4 giorni con terreno fresco contenente farmaci.
5) I conteggi delle cellule viventi vengono eseguiti a un ciclo fisso (ad esempio, ogni 2 giorni) per determinare la concentrazione appropriata per prevenire la crescita di cellule non transfettate. Scegli la concentrazione minima che uccide la maggior parte delle cellule entro un numero ideale di giorni (solitamente 7-10 giorni), come concentrazione di lavoro per lo screening di una linea cellulare stabile.
3.4 Screening di cellule transfettate stabili
1) 48 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state sottoposte a subcoltura mediante terreno di coltura contenente igromicina B alla concentrazione appropriata (diretta o diluita). 【Nota】Gli antibiotici funzionano meglio sulle cellule in divisione attiva. Se le cellule sono troppo dense, l'antibiotico non le ucciderà. Dividere le cellule in modo che non siano più del 25% confluenti.
2) Cambiare il mezzo di setacciatura ogni 3-4 giorni.
3) Misurare la formazione della colonia cellulare dopo 7 giorni di screening. La formazione della colonia potrebbe richiedere un'altra settimana o più, a seconda del tipo di cellula ospite, della trasfezione e dell'efficacia dello screening.
4) Selezionare 5-10 cloni resistenti e trasferirli su piastre di coltura cellulare da 35 mm e coltivarli in un terreno di coltura contenente il farmaco per 7 giorni.
5) Sostituire con terreno fresco senza farmaci per la coltura.
4 Proprietà
L'igromicina B è una polvere di colore da bianco a marrone giallastro con un odore particolare, facilmente solubile in acqua, metanolo, etanolo, ecc. e forma facilmente sali con molti acidi organici e inorganici.
5 Conservazione del prodotto
La soluzione può essere conservata direttamente a 2~8℃ e può essere conservata per più di 6 mesi.
6 Attenzione
1) Le cellule transfettate con il gene hph sono resistenti all'igromicina e le cellule transfettate esprimono il gene in modo stabile o temporaneo.
2) Il gene di resistenza all'igromicina B (hyg o hph) è stato trovato in altri ceppi, tra cui Streptomyces hygroscopicus e Klebsiella pneumoniae, oltre che in E. Coli.
7 Raccomandazione del prodotto
Sììì fornisce Igromicina B in due forme, polvere (1 g/10 g, Cat#60225ES) e soluzione (50 mg/mL, Cat#60224ES).
| Nome del prodotto | Gatto# | Specificazione |
| Igromicina B (50 mg/mL) | 60224ES03 | 1 g (20 ml) |
| 60224ES10 | 10×1 g (20 ml) | |
| Igromicina B | 60225ES03 | 1 grammo |
| 60225ES10 | 10g |
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