L'apoptosi si riferisce generalmente a un tipo di morte cellulare programmata che avviene attraverso la regolazione dei geni intracellulari e dei loro prodotti durante lo sviluppo delle cellule o sotto l'azione di alcuni fattori. L'apoptosi svolge un ruolo importante nello sviluppo embrionale e nella morfogenesi, nella stabilità delle popolazioni cellulari normali nei tessuti, nella difesa e nella risposta immunitaria dell'organismo, nel danno cellulare e nell'invecchiamento causati da malattie o avvelenamenti, e nell'insorgenza e nella progressione dei tumori, e ha un potenziale significato terapeutico.

Gli eventi nel percorso apoptotico si verificano in una sequenza temporale, vale a dire che si verificano in sequenza e alla fine portano alla comparsa di corpi apoptotici, con il verificarsi dell'apoptosi.

Le sue caratteristiche tipiche sono le seguenti:

1. Apoptosi precoce: cambiamenti nella struttura della membrana cellulare, eversione della fosfatidilserina;

2. Apoptosi in fase iniziale e intermedia: la densità del citoplasma aumenta, il potenziale della membrana mitocondriale scompare, la permeabilità cambia e il citocromo C viene rilasciato nel citoplasma;

3. Apoptosi tardiva: trasduzione del segnale apoptotico;

4. Apoptosi tardiva: il DNA si degrada in frammenti di dimensioni pari a 180~200 bp.

Figura 1: Occorrenza e rilevamento di eventi sequenziali nel percorso dell'apoptosi

1. Apoptosi precoce: annessina-V/PI doppia colorazione (rilevamento di PS sulla membrana extracellulare)

Nelle normali cellule viventi, la fosfatidilserina (PS) si trova sul lato interno della membrana cellulare. Quando si verifica l'apoptosi, la membrana cellulare cambia e la PS si sposta dalla superficie interna della membrana cellulare alla superficie esterna della membrana cellulare. L'annessina-V è una proteina legante i fosfolipidi Ca2+ dipendente con un peso molecolare di 35-36 KD, che può legarsi alla PS con elevata affinità. Utilizzando l'annessina-V marcata con fluoresceina (FITC, Alexa fluor488, ecc.) come sonda, le cellule apoptotiche e le cellule viventi possono essere identificate tramite citometria a flusso o microscopio a fluorescenza.

Anche la PS delle cellule necrotiche passerà dalla superficie interna della membrana cellulare alla superficie esterna della membrana cellulare. L'annessina-V può anche riconoscere la PS sulla superficie delle cellule necrotiche, quindi l'annessina-V non può distinguere le cellule necrotiche da quelle apoptotiche. Inoltre, lo ioduro di propidio (PI) è un colorante di acido nucleico, che può legarsi al DNA nelle cellule e non può penetrare l'intera membrana cellulare. La membrana cellulare delle cellule apoptotiche precoci e delle cellule viventi è ancora intatta e il colorante PI non può entrare liberamente nella cellula attraverso la membrana cellulare per legarsi al DNA, quindi il colorante PI non può etichettare le cellule apoptotiche e le cellule viventi, ma il colorante PI può legarsi al DNA nella cellula attraverso la membrana cellulare delle cellule necrotiche. Il colorante PI nelle cellule morte emetterà fluorescenza rossa dopo essere stato eccitato dal laser a 488 nm e verrà ricevuto dal canale corrispondente. Pertanto, l'annessina V e la PI possono essere utilizzate insieme per distinguere le cellule viventi, le cellule apoptotiche precoci e le cellule necrotiche.

Figura 2: Analisi dei risultati della citometria a flusso dopo la doppia colorazione con annessina-v/pi

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2. Apoptosi precoce: colorazione JC-1 (rilevamento di cambiamenti del potenziale della membrana mitocondriale)

Il processo di apoptosi è spesso accompagnato dalla distruzione del potenziale transmembrana mitocondriale, che è ampiamente considerato uno dei primi eventi nel processo della cascata apoptotica. Avviene prima della comparsa delle caratteristiche dell'apoptosi nucleare (concentrazione della cromatina, rottura del DNA). Una volta che il potenziale transmembrana mitocondriale collassa, l'apoptosi cellulare è irreversibile. L'esistenza del potenziale transmembrana mitocondriale consente ad alcuni coloranti fluorescenti cationici lipofili come la rodamina 123, JC-1, JC-10 di legarsi alla matrice mitocondriale. L'aumento o la diminuzione della loro fluorescenza indica l'aumento o la diminuzione dell'elettronegatività della membrana interna mitocondriale.

JC-1 è ampiamente utilizzato per rilevare il potenziale della membrana mitocondriale △ΨM, che mostra un accumulo dipendente dal potenziale nei mitocondri. Nei mitocondri normali, JC-1 si aggrega nella matrice mitocondriale per formare un polimero che emette una forte fluorescenza rossa (ex=585 nm, em=590 nm); Nelle cellule apoptotiche, il potenziale transmembrana mitocondriale si è depolarizzato, JC-1 è stato rilasciato dai mitocondri, la concentrazione è diminuita e si è invertita nella forma monomerica emettendo fluorescenza verde. Pertanto, il cambiamento di colore riflette direttamente la variazione del potenziale della membrana mitocondriale. Il grado di depolarizzazione mitocondriale può essere misurato anche dal rapporto tra l'intensità della fluorescenza rossa/verde. Il rilevamento di JC-1 è un metodo comune.

3. Apoptosi tardiva: metodo TUNEL (metodo di marcatura in situ dei frammenti di DNA)

Nella fase avanzata dell'apoptosi, un gran numero di terminali 3-OH appiccicosi vengono prodotti a causa di rotture a doppio filamento o rotture a singolo filamento del DNA cromosomico. Sotto l'azione della desossiribonucleotide terminal transferasi (TdT), il dUTP marcato con luciferasi può essere legato al 3-terminale del DNA, in modo che le cellule apoptotiche possano essere rilevate, tali metodi sono chiamati etichettatura terminale deossinucleotidil transferasi mediata da dUTP nick end (TUNEL). Poiché le cellule normali o in proliferazione non hanno quasi rotture del DNA, non vi è formazione di 3-OH e poche possono essere colorate. TUNEL è in realtà un metodo di ricerca che combina biologia molecolare e morfologia. La colorazione in situ di un singolo nucleo apoptotico completo o corpo apoptotico può riflettere accuratamente le tipiche caratteristiche biochimiche e morfologiche dell'apoptosi. Può essere utilizzato per determinare la morfologia cellulare di sezioni di tessuto incluse in paraffina, sezioni di tessuto congelate, cellule coltivate e cellule isolate dai tessuti, e può rilevare un numero molto piccolo di cellule apoptotiche. Pertanto, è ampiamente utilizzato nello studio dell'apoptosi.

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