Il principio di rilevamento del kit di rilevamento dell'apoptosi Annexin V-Alexa Fluor488/PI è il seguente: nelle normali cellule viventi, la fosfotidilserina (PS) si trova nel lato interno della membrana cellulare, ma nelle cellule apoptotiche precoci, la PS si sposta dal lato interno della membrana cellulare alla superficie della membrana cellulare ed è esposta all'ambiente extracellulare. L'annessina-V è un Ca²⁺ Proteina legante i fosfolipidi dipendente da P-fosfolipidi con un peso molecolare di 35-36 KD, che si lega con elevata affinità al PS e si lega alla membrana cellulare delle cellule in fase di apoptosi precoce attraverso la fosfatidilserina esposta all'esterno della cellula.
Inoltre, lo ioduro di propidio (PI) viene fornito per distinguere le cellule precoci sopravvissute dalle cellule necrotiche o apoptotiche tardive. PI è un colorante di acido nucleico, che non può passare attraverso la membrana cellulare intatta delle cellule normali o delle cellule apoptotiche precoci, ma può passare attraverso la membrana cellulare delle cellule apoptotiche tardive e necrotiche e rendere rosso il nucleo. Quindi, quando l'annessina V è stata combinata con PI, PI è stata esclusa dalle cellule viventi (annessina V^-/PI^-) e cellule apoptotiche precoci (Annessina V⁺/PI^-). Al contrario, le cellule apoptotiche e necrotiche tardive erano doppiamente positive per Alexa Fluor488 e PI (Annexin V⁺/PI⁺).

Componenti del prodotto

Spedizione e stoccaggio

I componenti vengono spediti con un pacco di ghiaccio e possono essere conservati a -20°C per 1 anno.

Attenzione

1) Poiché l'apoptosi è un processo rapido, si raccomanda di analizzare i campioni entro 1 ora dalla colorazione.
2) Per le cellule aderenti, la digestione è un passaggio critico. Non usare EDTA nella soluzione digestiva poiché EDTA può influenzare il legame dell'Annessina V alla PS.
3) Se il campione è di sangue, assicurarsi di rimuovere le piastrine dal sangue. Poiché le piastrine contengono PS, che può legarsi all'Annessina V, interferendo con i risultati. È possibile utilizzare un agente tampone contenente EDTA e lavare via le piastrine mediante centrifugazione a 200 g.
4) Centrifugare brevemente il reagente prima di aprire il coperchio e versare il liquido sulla parete interna del coperchio sul fondo della provetta per evitare che il liquido fuoriesca quando si apre il coperchio.
5) L'annessina V-Alexa Fluor488 e il PI sono sostanze fotosensibili e devono essere tenute al riparo dalla luce durante la manipolazione.
6) Solo per uso di ricerca!

Istruzioni

1.1 Tintura campione
1.a) cella di sospensione: Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 300 g per 5 minuti a 4°C.
b) cellula aderente: dopo la digestione con tripsina senza EDTA, le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 300 g per 5 min a 4 °C. Il tempo di digestione con tripsina non dovrebbe essere troppo lungo per prevenire falsi positivi.
2. Le cellule sono state lavate due volte con PBS preraffreddato a 4 °C, ogni volta utilizzando 300 g, e centrifugate a 4 °C per 5 min.
3. Le cellule sono state risospese aggiungendo 250 μL di tampone di legame 1× e la concentrazione è stata regolata a 1×106/mL.
4. Sono stati aggiunti 100 μL di sospensione cellulare in una provetta per citometria a flusso da 5 mL, sono stati aggiunti 5 μL di Annexin V-Alexa Fluor 488 e 10 μL di PI e miscelati delicatamente.
5. La reazione è stata tenuta al riparo dalla luce e a temperatura ambiente per 15 minuti.
6. Sono stati aggiunti 400 μL di tampone di legame 1×, miscelati e i campioni sono stati rilevati mediante citometria a flusso entro 1 ora.
[Note]: Per evitare la perdita di cellule durante il lavaggio delle cellule, è possibile utilizzare una piccola punta per aspirare il fluido.
1.2 Analisi citofluorimetrica
Alexa Fluor488 ha una lunghezza d'onda di eccitazione massima di 488 nm e una lunghezza d'onda di emissione massima di 519 nm; la lunghezza d'onda di eccitazione massima del complesso PI-DNA era di 535 nm e la lunghezza d'onda di emissione massima era di 615 nm. CellQuest e altri software sono stati utilizzati per analizzare e disegnare un dot plot a due colori con Alexa Fluor488 come ascissa e PI come ordinata. Raccogli 10.000 eventi per campione.
1.3 Analisi microscopica a fluorescenza
1) Versare una goccia di sospensione cellulare doppiamente colorata con annessina V-FITC/PI sul vetrino e coprire le cellule con un coprioggetto.
2) È stato osservato al microscopio a fluorescenza con un filtro a due colori. Il segnale di fluorescenza dell'annessina V-FITC era verde e il segnale di fluorescenza del PI era rosso.