Il kit di rilevamento dell'apoptosi cellulare Annexin V-EGFP/PI utilizza Annexin V marcata con EGFP come sonda per rilevare il verificarsi di un'apoptosi cellulare precoce.
Il principio di rilevamento è il seguente: nelle normali cellule viventi, la fosfotidilserina (PS) si trova sul lato interno della membrana cellulare, ma nelle cellule apoptotiche precoci, la PS si sposta dal lato interno della membrana cellulare alla superficie della membrana cellulare ed è esposta all'ambiente extracellulare. L'annessina-V è una Ca²⁺ -proteina legante i fosfolipidi dipendente con un peso molecolare di 35-36 kDa che si lega al PS con elevata affinità. La fosfatidilserina può legarsi alla membrana delle cellule apoptotiche precoci attraverso la fosfatidilserina esposta all'esterno della cellula.
Inoltre, lo ioduro di propidio (PI) viene fornito per distinguere le cellule precoci sopravvissute dalle cellule necrotiche o apoptotiche tardive. PI è un colorante di acido nucleico, che non può passare attraverso la membrana cellulare intatta delle cellule normali o delle cellule apoptotiche precoci, ma può passare attraverso la membrana cellulare delle cellule apoptotiche tardive e necrotiche e rendere rosso il nucleo. Quindi, quando l'annessina V è stata combinata con PI, PI è stata esclusa dalle cellule viventi (annessina V^-/PI^-) e cellule apoptotiche precoci (Annessina V⁺/PI^-). Le cellule apoptotiche tardive e necrotiche erano doppiamente positive sia per EGFP che per PI (Annessina V⁺/PI⁺).
Questo kit è adatto per la citometria a flusso e la microscopia a fluorescenza.

Componenti del prodotto

Spedizione e stoccaggio

I componenti vengono spediti con un impacco di ghiaccio e possono essere conservati a -20°C al riparo dalla luce ed evitando ripetuti congelamenti e scongelamenti per 1 anno.
[Note]: Se deve essere utilizzato ripetutamente in un breve periodo, può essere conservato a 4 ℃ e protetto dalla luce per sei mesi.

Attenzione

1) Poiché l'apoptosi è un processo rapido, si raccomanda di analizzare i campioni entro 1 ora dalla colorazione.
2) Per le cellule aderenti, la digestione è un passaggio critico. Non usare EDTA nella soluzione digestiva poiché EDTA può influenzare il legame dell'Annessina V alla PS.
3) L'Annessina V-FITC, ma non l'Annessina V-EGFP, dovrebbe essere utilizzata per fissare le cellule, ad esempio per rilevare l'apoptosi e il ciclo cellulare allo stesso tempo, perché l'EGFP verrebbe denaturato e perderebbe la sua capacità di eccitare la fluorescenza durante la fissazione. Le cellule sono state incubate con l'Annessina V-FITC prima della fissazione e l'Annessina V-FITC non legata è stata lavata via con il Binding Buffer.Poiché l'aumento della permeabilità cellulare durante la fissazione crea detriti cellulari che possono legarsi all'annessina V e interferire con i risultati.
4) Se il campione è di sangue, assicurarsi di rimuovere le piastrine dal sangue. Poiché le piastrine contengono PS, che può legarsi all'Annessina V, interferendo con i risultati. Le piastrine possono essere lavate via utilizzando un agente tampone contenente EDTA e centrifugando a 200 g.
5) Centrifugare brevemente il reagente prima di aprire il coperchio e versare il liquido sulla parete interna del coperchio sul fondo della provetta per evitare che il liquido fuoriesca quando si apre il coperchio.
6) L'annessina V-EGFP e PI sono sostanze fotosensibili, pertanto evitare l'esposizione alla luce durante il funzionamento.
7) Solo per uso di ricerca!

Istruzioni

Progettazione dell'esperimento
Tubo vuoto: per la regolazione della tensione sono state utilizzate cellule di controllo negativo senza annessina V-EGFP e soluzione colorante PI.
Provette colorate singole: sono state utilizzate cellule di controllo positivo, integrate solo con annessina V-EGFP, per modulare la compensazione.
Provetta di rilevamento: le cellule sono state trattate con soluzione di colorazione Annexin V-EGFP e PI. I dati sperimentali sono stati ottenuti regolando i parametri della provetta vuota e della provetta con singolo colorante.
1.1 Tintura del campione
1) cella di sospensione: Le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 300 g per 5 min a 4 °C.
cellula aderente: dopo la digestione con tripsina senza EDTA, le cellule sono state raccolte mediante centrifugazione a 300 g per 5 min a 4 °C. Il tempo di digestione con tripsina non deve essere troppo lungo per evitare falsi positivi.
2) Le cellule sono state lavate due volte con PBS preraffreddato, ogni volta a 300 g, e centrifugate a 4 ℃ per 5 min.
3) Le cellule sono state risospese con tampone di legame 1× e la concentrazione è stata regolata a 1~5 ×106/mL.
4) Sono stati aggiunti 100 μL di sospensione cellulare in provette per citometria a flusso da 5 mL, sono stati aggiunti 5 μL di annessina V-EGFP e le cellule sono state miscelate e incubate per 5 minuti a temperatura ambiente sotto la luce.
5) Aggiungendo 10 μl di soluzione PI e 400 μl di PBS, la colorazione è stata eseguita immediatamente.
[Note]: Quando si utilizza la citometria a flusso per rilevare l'apoptosi, il PI è notevolmente influenzato dal tempo e un tempo troppo lungo porterà a un aumento della colorazione del PI, quindi la citometria a flusso deve essere completata entro 1 ora.
1.2 Analisi citofluorimetrica
La lunghezza d'onda di eccitazione massima di EGFP era 488 nm e la lunghezza d'onda di emissione massima era 507 nm; la lunghezza d'onda di eccitazione massima del complesso PI-DNA era 535 nm e la lunghezza d'onda di emissione massima era 615 nm. Per l'analisi è stato utilizzato un software come CellQuest ed è stato disegnato un dot plot a due colori, EGFP è l'ascissa e PI è l'ordinata. Raccogli 10.000 eventi per campione. In un tipico esperimento, le cellule possono essere divise in tre sottogruppi, le cellule viventi hanno solo una fluorescenza di fondo a intensità molto bassa, le cellule apoptotiche precoci hanno solo una forte fluorescenza verde e le cellule apoptotiche tardive hanno una doppia colorazione con fluorescenza verde e rossa.