Quando le cellule subiscono l'apoptosi, attivano enzimi endonucleasi che tagliano il DNA genomico tra i nucleosomi. Dopo che il DNA è stato estratto durante l'apoptosi, è stato possibile trovare una scala di DNA di 180-200 bp.
Il kit di rilevamento dell'apoptosi TUNEL (TdT mediated dUTP Nick End Labeling) (Alexa Fluor 640) può essere utilizzato per rilevare la frammentazione del DNA nucleare nel processo apoptotico tardivo delle cellule tissutali. Il principio è che sotto l'azione della Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT), Alexa Fluor 640-12-DUTP viene incorporato nel terminale 3´-idrossile (3´-OH) esposto durante la rottura del DNA genomico. Pertanto, può essere rilevato tramite microscopia a fluorescenza o citometria a flusso. Alexa Fluor 640 è un colorante fluorescente rosso con elevata stabilità e forte luminosità.
Questo kit ha un'ampia gamma di applicazioni e può essere utilizzato per rilevare l'apoptosi in sezioni congelate o in paraffina, nonché in cellule coltivate aderenti o sospese.

Componenti del prodotto

Spedizione e stoccaggio

I componenti vengono spediti con un pacco di ghiaccio e possono essere conservati a -20°C per 1 anno.

Attenzione

1. È necessario preparare il proprio PBS per lavare le cellule, una soluzione di quenching anti-fluorescenza per sigillare le compresse e paraformaldeide al 4% per il fissaggio. I leucociti potrebbero dover essere coltivati ​​per un lungo periodo.
2. Solo per uso di ricerca!

Istruzioni

1. La preparazione del campione
1.1 Sezioni di tessuto incluse in paraffina
1.1.1.Le sezioni di tessuto in paraffina sono state immerse in xilene per 5 minuti a temperatura ambiente e ripetute una volta per rimuovere completamente la paraffina.
1.1.2.Immergere le sezioni in etanolo al 100% per 5 minuti a temperatura ambiente e ripetere una volta.
1.1.3.A temperatura ambiente, i campioni sono stati immersi in un gradiente di etanolo (90, 80, 70%) per 3 minuti ogni volta.
1.1.4.Risciacquare delicatamente le sezioni con PBS e tamponare con cura il liquido in eccesso attorno al campione sui vetrini con carta da filtro. In questo caso, è possibile utilizzare la penna di paraffina o la penna idrofobica per disegnare il contorno della distribuzione del campione attorno al campione, il che è comodo per l'elaborazione della permeabilità a valle e l'operazione di etichettatura della bilancia. Non lasciare asciugare il campione durante l'esperimento. Mettere il campione elaborato nella scatola umida per mantenere il campione bagnato.
1.1.5.2 mg/mL di soluzione di proteinasi K è stata diluita con PBS in un rapporto di 1:100 per raggiungere una concentrazione finale di 20 μg/mL.
1.1.6.100 μL di soluzione di Proteinasi K a una concentrazione di 20 μg/mL sono stati aggiunti a ciascun campione fino a ricoprirlo completamente e incubati a temperatura ambiente per 20 min.
[Note]: La proteinasi K aiuta i tessuti e le cellule a diventare permeabili ai reagenti di colorazione nelle fasi successive. Un tempo di incubazione troppo lungo aumenterà il rischio che le sezioni di tessuto cadano dalla piastra di supporto nelle fasi di lavaggio successive, mentre un tempo di incubazione troppo breve potrebbe causare un trattamento di permeabilità insufficiente e influire sull'efficienza dell'etichettatura. Per ottenere risultati migliori, potrebbe essere necessario ottimizzare il tempo di incubazione della proteinasi K.
1.1.7.Risciacquare il campione 2-3 volte con soluzione PBS, rimuovere delicatamente il liquido in eccesso e tamponare con cura il liquido attorno al campione sul vetrino con carta da filtro. Il campione elaborato viene posto in una scatola umida per mantenerlo umido.
1.2 Sezione congelata del tessuto
1.2.1. Rimuovere le sezioni congelate e riportarle a temperatura ambiente. I vetrini sono stati immersi in una soluzione di paraformaldeide al 4% (sciolta in PBS) e fissati e incubati per 30 minuti a temperatura ambiente.
1.2.2. Rimuovere delicatamente il liquido in eccesso e utilizzare carta da filtro per tamponare con cura il liquido in eccesso attorno al campione sul vetrino.
1.2.3. I vetrini sono stati immersi nella soluzione PBS, incubati a temperatura ambiente per 15 minuti e lavati nuovamente con PBS per un totale di 2 volte.
1.2.4. Rimuovere delicatamente il liquido in eccesso e tamponare con cura il vetrino con carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso attorno al campione. In questo caso, è possibile utilizzare la penna di paraffina o la penna idrofobica per disegnare il contorno della distribuzione del campione attorno al campione, il che è comodo per l'elaborazione della permeabilità a valle e l'operazione di etichettatura della bilancia. Durante l'esperimento, non lasciare asciugare il campione e metti il ​​campione elaborato nella scatola umida per mantenerlo bagnato.
1.2.5. La soluzione di proteinasi K da 2 mg/mL è stata diluita con PBS in un rapporto di 1:100 per raggiungere una concentrazione finale di 20 μg/mL.
1.2.6. A ciascun campione sono stati aggiunti 100 μL di soluzione di Proteinasi K a una concentrazione di 20 μg/mL fino a ricoprirlo completamente e incubati a temperatura ambiente per 10 min.
[Note]: La proteinasi K aiuta i tessuti e le cellule a essere permeabili ai reagenti di colorazione nelle fasi successive. Un tempo di incubazione troppo lungo aumenterà il rischio che le sezioni di tessuto cadano dalla piastra di supporto nelle fasi di lavaggio successive, mentre un tempo di incubazione troppo breve potrebbe causare un trattamento di permeabilità insufficiente e influenzare l'efficienza dell'etichettatura. Potrebbe essere necessario ottimizzare il tempo di incubazione della proteinasi K se non si ottenessero risultati migliori.
1.2.7. Sciacquare il campione 2-3 volte in un becher aperto contenente una soluzione PBS.
[Note]: Per evitare la perdita di campione durante la fase di pulizia, si consiglia di non lavare la bottiglia, ma di immergere i vetrini in soluzione PBS 2-3 volte per la pulizia.
1.2.8. Rimuovere delicatamente il liquido in eccesso e utilizzare carta da filtro per tamponare con cura il liquido attorno al campione sul vetrino.Il campione elaborato viene posto in una scatola umida per preservarne l'umidità.
1.3 Preparazione del foglio di scansione delle celle
Le cellule aderenti sono state coltivate su Lab-Tek Chamber Slides. Dopo il trattamento di induzione dell'apoptosi, i vetrini sono stati lavati due volte con PBS.
1.4 Preparazione degli strisci cellulari (prendendo come esempio i vetrini rivestiti di polilisina)
1.4.1. Le cellule sono state risospese in PBS a una concentrazione di circa 2×107 cellule/mL, 50-100 μL della sospensione cellulare sono stati aspirati su vetrini rivestiti di polilisina e la sospensione cellulare è stata delicatamente aperta con un vetrino pulito.
1.4.2. Le cellule sono state fissate e i vetrini sono stati immersi in una vasca di colorazione contenente il 4% di paraformaldeide appena preparata in PBS e posti a 4 °C per 25 min.
1.4.3. I vetrini sono stati lavati, immersi in PBS e lasciati a temperatura ambiente per 5 minuti. Lavare nuovamente con PBS.
1.4.4. Rimuovere delicatamente il liquido in eccesso e tamponare con cura il vetrino con carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso attorno al campione. In questo caso, è possibile utilizzare una penna di paraffina o una penna idrofobica per delineare la distribuzione del campione attorno al campione per facilitare l'elaborazione della permeabilità a valle e bilanciare le operazioni di etichettatura. Durante l'esperimento, non lasciare asciugare il campione e metti il ​​campione elaborato nella scatola umida per mantenerlo bagnato.
1.4.5. La soluzione di proteinasi K da 2 mg/mL è stata diluita con PBS in un rapporto di 1:100 per raggiungere una concentrazione finale di 20 μg/mL.
1.4.6. A ciascun campione sono stati aggiunti 100 μL di soluzione di Proteinasi K a una concentrazione di 20 μg/mL per coprirlo completamente e incubato a temperatura ambiente per 5 minuti (può anche essere immerso in una soluzione di Triton X-100 allo 0,2% preparata in PBS e incubata a temperatura ambiente per 5 minuti per il trattamento di permeabilità).
[Note]: La proteinasi K aiuta i tessuti e le cellule a essere permeabili ai reagenti di colorazione nelle fasi successive. Un tempo di incubazione troppo lungo aumenterà il rischio che le sezioni di tessuto cadano dalla piastra di supporto nelle fasi di lavaggio successive, mentre un tempo di incubazione troppo breve potrebbe causare un trattamento di permeabilità insufficiente e influenzare l'efficienza dell'etichettatura. Potrebbe essere necessario ottimizzare il tempo di incubazione della proteinasi K se non si ottenessero risultati migliori.
1.4.7. Sciacquare il campione 2-3 volte con PBS, rimuovere delicatamente il liquido in eccesso e tamponare con cura il liquido attorno al campione sul vetrino con carta da filtro. I campioni elaborati sono stati posti in una scatola umida.
2. Fasi del trattamento con DNasi dei controlli positivi
Dopo la permeazione del campione, le cellule sono state trattate con DNasi I per preparare vetrini di controllo positivo. Questo processo solitamente fa sì che la maggior parte delle cellule trattato per mostrare fluorescenza verde.
[Note]: Il trattamento con Dnasi I delle cellule immobilizzate provoca la rottura del DNA cromosomico, producendo molte estremità 3' del DNA che possono essere etichettate.
2.1. Diluire il tampone 10×DNase I con acqua deionizzata in un rapporto di 1:10 (sono necessari 200 µL di tampone 1×DNase I per ogni campione, ovvero 20 µL di tampone 10×DNase I e 180 µL di acqua deionizzata sono necessari per la diluizione). Una goccia di 100 µl è stata aggiunta al campione permeabile e incubata per 5 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 1 µL di DNase I (1U/µL) ai restanti 100 µL di tampone 1×DNase I per ottenere una concentrazione finale di 10 U/mL.
2.2.Il liquido è stato delicatamente rimosso, quindi sono stati aggiunti 100 μL di tampone contenente 10 U/mL di DNasi I e incubati per 10 minuti a temperatura ambiente.
2.3. Picchiettare il vetrino per rimuovere il liquido in eccesso e lavarlo accuratamente 3-4 volte in una vasca di colorazione con acqua deionizzata.
[Note]: Per i vetrini di controllo positivo deve essere utilizzata una vasca di colorazione separata, altrimenti la DNasi I residua sui vetrini di controllo positivo potrebbe causare un elevato effetto di fondo sui vetrini sperimentali.
3. Etichettatura e rilevamento
3.1.Il tampone di equilibratura (5 x tampone di equilibratura) viene diluito con acqua deionizzata in un rapporto di 1:5 (per ogni campione sono necessari 100 μL di tampone di equilibratura 1 x).
3.2. A ciascun campione è stato aggiunto il tampone di equilibratura (100 μL 1×tampone di equilibratura) per equilibrare completamente l'area e incubato per 10-30 min a temperatura ambiente. In alternativa, far scorrere in una vasca con 1 x tampone di equilibratura per assicurarsi che i vetrini non equilibrino il campione. Scongelare la miscela di marcatura Alexa Fluor 640-12-dUTP su ghiaccio mentre si bilanciano le cellule e preparare una quantità sufficiente di tampone di incubazione TdT per tutti gli esperimenti e le reazioni di controllo positivo facoltative secondo la Tabella 1. Per una reazione standard con un'area inferiore a 5 cm2, il volume è 50 μl e 50 μL vengono moltiplicati per il numero di reazioni sperimentali e di controllo positivo per determinare il volume totale di tampone di incubazione TdT richiesto. Per campioni con aree superficiali maggiori, il volume del reagente può essere aumentato proporzionalmente.

Tabella 1. Tamponi di incubazione TdT preparati per esperimenti e reazioni di controllo positivo facoltative

[Sistema di controllo negativo]: è stato preparato un tampone di incubazione di controllo senza l'enzima TdT e l'enzima TdT è stato sostituito con ddH2O.
3.3. La maggior parte dei 100 μL di 1×Equilibration Buffer è stata lavata via con carta assorbente attorno all'area equilibrata e poi sono stati aggiunti 50 μLTdT di incubazione Buffer a un'area di 5 cm2 di cellule. Non lasciare che le cellule si secchino. Dopo questo, il vetrino deve essere protetto dalla luce.
3.4. Posizionare un coprioggetto di plastica sulle cellule per garantire una distribuzione uniforme dei reagenti e posizionare un tovagliolo di carta inumidito con acqua sul fondo della scatola umida. I vetrini sono stati posizionati in una scatola umida e incubati a 37 °C per 60 min. Avvolgere la scatola umida in un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce.
[Note]: Il coprioggetto in plastica può essere tagliato a metà prima dell'uso. Piegare il bordo del coprioggetto per una facile rimozione e manipolazione.
3.5. I coprioggetto in plastica sono stati rimossi e le sezioni sono state incubate in soluzione PBS a temperatura ambiente per 5 minuti. Quindi le sezioni sono state lavate due volte con PBS fresco.
3.6. Strofinare delicatamente la soluzione PBS attorno e sul retro del campione con carta da filtro.
[Note]: Per ridurre lo sfondo, dopo aver lavato i vetrini una volta con PBS, possono essere lavati con PBS contenente 0,1% di Triton X-100 e 5 mg/mL di BSA 3 volte, 5 minuti ogni volta, in modo che i marcatori liberi non reagiti possano essere chiari e puliti.
3.7. I campioni sono stati colorati in una vasca di colorazione e i vetrini sono stati immersi in una vasca di colorazione contenente soluzione PI (1 μg/mL, appena preparata e diluita con PBS) al buio e lasciati a temperatura ambiente per 5 minuti. (Facoltativo): i campioni sono stati colorati in una vasca di colorazione e i vetrini sono stati immersi in una vasca di colorazione contenente soluzione DAPI (2 μg/mL, appena preparata e diluita con PBS) al buio e lasciati a temperatura ambiente per 5 minuti.
3.8.Lavare il campione, immergere il vetrino in acqua deionizzata e lasciarlo a temperatura ambiente per 5 minuti. Ripetere due volte per un totale di tre lavaggi.
3.9. L'acqua in eccesso sul vetrino è stata asciugata e sono stati aggiunti 100 μl di PBS all'area del campione per mantenerlo umido.
3.10. I campioni sono stati immediatamente analizzati al microscopio a fluorescenza, la fluorescenza rossa di Alexa Fluor 640 è stata rilevata a 620 nm e il DAPI blu è stato osservato a 460 nm. Il DAPI poteva colorare di blu sia le cellule apoptotiche che quelle non apoptotiche e solo nei nuclei apoptotici è stato incorporato Alexa Fluor 640-12-dUTP e localizzata la fluorescenza rossa. Se necessario, i vetrini possono essere conservati durante la notte a 4 °C al buio.
4. Le cellule in sospensione sono state rilevate mediante citometria a flusso
4.1. 3~5×106 cellule sono state lavate due volte con PBS mediante centrifugazione (300×g) a 4 °C, centrifugate a 300 g a 4 °C per 10 min e quindi risospese in 0,5 mL di PBS.
4.2. Le cellule sono state fissate e sono stati aggiunti 5 mL di soluzione di paraformaldeide all'1% preparata in PBS e posti su ghiaccio per 20 minuti.
4.3. Le cellule sono state centrifugate a 300 × g a 4 °C per 10 min, e il surnatante è stato rimosso e risospeso in 5 mL di PBS. Il lavaggio è stato ripetuto una volta e le cellule sono state risospese con 0,5 mL di PBS.
4.4. Le cellule sono state permeate e sono stati aggiunti 5 mL di etanolo al 70% pre-raffreddato con ghiaccio e incubato a -20 °C per 4 ore. Le cellule potevano essere conservate in etanolo al 70% a -20℃ per una settimana, oppure le cellule potevano essere permeabili con soluzione Triton X-100 allo 0,2% preparata in PBS e conservata a temperatura ambiente per 5 min.
4.5. Le cellule sono state centrifugate a 300 × g per 10 min e risospese in 5 mL di PBS. La centrifugazione è stata ripetuta e risospese in 1 mL di PBS.
4.6. Trasferire 2 × 106 cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.
4.7. L'equilibrazione è stata centrifugata a 300 × g per 10 min, e il surnatante è stato rimosso e risospeso con 80 μL di 1 × Equilibration Buffer. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
4.8. Durante il bilanciamento delle cellule, la miscela di marcatura Alexa Fluor 640-12-dUTP è stata sciolta su ghiaccio ed è stata preparata una quantità sufficiente di tampone di incubazione TdT per tutte le reazioni secondo la Tabella 1. Per una reazione standard di 2 × 106 cellule, il volume era di 50 μL e 50 μL sono stati moltiplicati per il numero di reazioni per determinare il volume totale di tampone di incubazione TdT richiesto.
4.9. Le cellule sono state centrifugate a 300 × g per 10 min, il surnatante è stato rimosso e il precipitato è stato risospeso in 50 μL di tampone di incubazione TdT e incubato a 37℃ per 60 min, al riparo dalla luce. Le cellule sono state risospese delicatamente ogni 15 min con una micropipetta.
4.10. La reazione è stata terminata aggiungendo 1 mL di EDTA 20 mM e mescolando delicatamente con una micropipetta.
4.11. Dopo centrifugazione a 300 g per 10 min, il surnatante è stato scartato e il precipitato è stato risospeso in 1 mL di soluzione Triton X-100 allo 0,1% preparata in PBS, contenente 5 mg/mL di BSA. La soluzione è stata ripetuta una volta e lavata due volte in totale.
4.12. Le cellule sono state analizzate mediante citometria a flusso ed è stata misurata la fluorescenza rossa Alexa Fluor 640 a 620 nm.