1.Prefazione
I macrofagi sono grandi fagociti differenziati dai monociti nel sangue. Sono presenti in quasi tutti i tessuti, in particolare quelli che sono in frequente contatto con il mondo esterno come pelle, polmoni e intestino. I macrofagi svolgono un ruolo fondamentale in molti processi biologici come la difesa immunitaria umana, la risposta infiammatoria, la riparazione dei tessuti, la regolazione immunitaria e lo sviluppo delle malattie.
I macrofagi umani primari sono difficili da isolare dai tessuti in numero sufficiente e non proliferano in coltura. I macrofagi derivati dai monociti forniscono un'eccellente alternativa perché i monociti nel sangue umano sono facilmente ottenibili in grandi quantità e possono essere differenziati in macrofagi in vitro.
2. Funzioni biologiche dei macrofagi
- Fagocitosi
I macrofagi riconoscono e inglobano patogeni e detriti cellulari morti tramite recettori sulla loro superficie. Questo processo non solo aiuta a eliminare l'infezione, ma impedisce anche a queste sostanze di accumularsi nel corpo, il che potrebbe causare infiammazioni o altri problemi.
- Difesa anti-patogeno
I macrofagi combattono i patogeni producendo sostanze chimiche che uccidono i microrganismi, come gli ossidi reattivi dell'ossigeno e dell'azoto, nonché citochine e chemiochine che regolano le risposte infiammatorie.
- Regolazione dell'infiammazione
I macrofagi svolgono un ruolo complesso nelle risposte infiammatorie. Possono non solo promuovere l'infiammazione rilasciando citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e l'interleuchina 1 (IL-1), ma anche inibire l'infiammazione producendo citochine anti-infiammatorie come IL-10 e TGF-β.
- Riparazione e ricostruzione dei tessuti
Dopo una risposta infiammatoria, i macrofagi aiutano a riparare e rigenerare i tessuti secernendo vari fattori di crescita. Eliminano i resti del danno, promuovendo al contempo la formazione di nuovi tessuti.
- Immunomodulazione
I macrofagi promuovono risposte immunitarie specifiche presentando antigeni alle cellule T. Allo stesso tempo, regolano altri componenti del sistema immunitario secernendo varie citochine, come la regolazione dell'attività delle cellule T e delle cellule B.
- Relazione con le malattie
I macrofagi svolgono un ruolo importante nello sviluppo di numerose malattie, tra cui malattie infettive, malattie autoimmuni, tumori e malattie infiammatorie croniche come l'aterosclerosi.
3. Classificazione dei macrofagi
In base al loro stato di attivazione e alla loro funzione, i macrofagi possono essere suddivisi in due categorie principali: M1 e M2. Questi due sottotipi svolgono ruoli diversi nella risposta immunitaria e nella regolazione dell'infiammazione.
Macrofagi M1
I macrofagi M1 sono stimolati principalmente da citochine come l'interferone gamma (IFN-γ) e il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), e hanno caratteristiche pro-infiammatorie. Hanno una forte attività antimicrobica, possono produrre radicali liberi dell'ossigeno e fattori infiammatori e partecipano all'uccisione e all'eliminazione di microrganismi patogeni come batteri e virus.
I macrofagi M1 partecipano alla difesa immunitaria e alla risposta infiammatoria dell'organismo, favoriscono l'infiltrazione di cellule infiammatorie e immunitarie, aiutano a eliminare i tessuti infetti e danneggiati e favoriscono l'insorgenza e il mantenimento delle risposte infiammatorie immunitarie.
Macrofagi M2
I macrofagi M2 sono stimolati principalmente da citochine come l'interleuchina-4 (IL-4) e l'interleuchina-13 (IL-13), e hanno caratteristiche antinfiammatorie e riparatrici. Partecipano ai processi di riparazione e rigenerazione dei tessuti, promuovono risposte antinfiammatorie e regolazione immunitaria.
I macrofagi M2 svolgono un ruolo importante nella fase avanzata dell'infiammazione e della riparazione dei tessuti, promuovono la risoluzione dell'infiammazione e la riparazione dei tessuti, regolano l'equilibrio delle risposte immunitarie e promuovono la rigenerazione e la riparazione dei tessuti.
Figura 1. Riepilogo dei principali stati di polarizzazione dei macrofagi attivati [1]
4. Isolamento, coltura e differenziazione dei macrofagi in vitro
4.1 Metodo di separazione
- Isolamento dal sangue periferico
Isolamento dei monociti: le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) vengono isolate utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità (ad esempio, Ficoll-Paque). Il campione di sangue viene aggiunto allo strato superiore di Ficoll e, dopo la centrifugazione, i monociti si trovano tra gli strati di plasma e Ficoll.
Isolamento dei macrofagi: dopo che i monociti sono stati isolati dai PBMC, le cellule precursori mononucleari possono essere ulteriormente isolate tramite adesione plastica. I monociti vengono coltivati in piastre di coltura di plastica per diverse ore, le cellule non aderenti vengono rimosse e le cellule aderenti rimanenti sono principalmente cellule precursori mononucleari.
- Isolamento dai tessuti
I campioni di tessuto vengono suddivisi in sospensioni monocellulari mediante trattamento meccanico e/o enzimatico (ad esempio, collagenasi e DNasi). Le cellule non bersaglio vengono rimosse mediante centrifugazione a gradiente di densità o selezione negativa (utilizzando anticorpi e biglie magnetiche) e vengono raccolti i macrofagi.
4.2 Metodo di coltura
I terreni di coltura comunemente usati includono RPMI 1640 o IMDM, che solitamente devono essere integrati con il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di penicillina/streptomicina e i fattori di crescita necessari. Le condizioni di coltura sono solitamente in un'incubatrice a 37°C e al 5% di CO2
4.3 Metodo di induzione della differenziazione
- Differenziazione dalle cellule precursori mononucleari
Utilizzo di M-CSF: Aggiungere il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) al terreno di coltura, solitamente a una concentrazione di 20-50 ng/mL, e continuare la coltura per 7-10 giorni per indurre la differenziazione delle cellule precursori mononucleari in macrofagi.
Utilizzo di GM-CSF: Anche il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF) può indurre la differenziazione dei macrofagi, in particolare la tendenza a produrre macrofagi M1 (pro-infiammatori).
- Ulteriore regolazione del fenotipo e della funzione
Macrofagi M1: può essere indotta aggiungendo IFN-γ (interferone-γ) e LPS (lipopolisaccaride) al terreno di coltura.
Macrofagi M2: può essere indotta aggiungendo citochine antinfiammatorie come IL-4 e IL-13.
Questi metodi consentono ai ricercatori di studiare le varie funzioni biologiche dei macrofagi e il loro comportamento in condizioni patologiche in vitro. Le condizioni operative specifiche di ogni fase (come densità cellulare, tempo di coltura, concentrazione di fattori aggiunti, ecc.) potrebbero dover essere ottimizzate in base allo scopo specifico dell'esperimento.
Tabella 1.Condizioni di coltura e induzione dei macrofagi
| Fonte cellulare | Terreno di coltura | Aggiunte iniziali | Polarizzazione M1 | Polarizzazione M2 |
| Cellula THP-1 | Numero di giri 1640 | 100 ng/mL di PMA | 20 ng/mL di IFN-γ 100 ng/ml di LPS | 20 ng/mL di IL-4 20 ng/mL di IL-13 |
| Monociti | Numero di giri 1640 | M1:50 ng/mL di GM-CSF M2: 50 ng/mL di M-CSF | 10 ng/ml di LPS 50 ng/mL di IFN-γ | M2a: 20 ng/mL IL-4 M2b: IgG+LPS M2c: 20 ng/ml TGF-β1 o 10 ng/ml IL-10 |
| Mfreccia | IMDM | 10-50 ng/mL di M-CSF | 100 ng/ml di LPS (È possibile aggiungere 50 ng/mL di IFN-γ) | 10 ng/ml di IL-4 (si possono aggiungere 10 ng/mL IL-13) |
| ARW264.7 Cell | DMEM | / | 100 ng/ml di LPS | 20 ng/ml IL-4 (è possibile aggiungere 20 ng/mL di IL-10） |
5. Dati di analisi
YEASEN fornisce una serie di prodotti citochinici ad alta attività HiActive® correlati alla coltura dei macrofagi per supportare la ricerca sui macrofagi.
Citochine altamente attive HiActive®：È stata verificata l'attività biologica di ciascuna citochina per garantirne l'elevata attività.
Dati di verifica dell'attività:
Proteina M-CSF del topo ricombinante
Figura 1. Misurato in un test di proliferazione cellulare utilizzando il topo M‑NFS‑60 cellule linfoblastiche della leucemia mieloide. L'ED50 per questo effetto è in genere 16,74 -25,83 ng/ml.
Ricombinante GM-CSF del topo Proteina
Figura 2. L'ED50 come determinato da un test di proliferazione cellulare utilizzando cellule murine FDC-P1 è 2,79-12,84 pg/mL.
Ricombinante IL-10 umano Proteina
Figura 3. L'ED50 determinato da un test di proliferazione cellulare utilizzando cellule MC/9 murine è inferiore a 0,1 ng/mL, corrispondente a un'attività specifica di > 1,0×107 UI/mg.
Prodotti correlati
| Classificazione | Specie | Gatto | Specificazione |
| G-CSF | Umano | 2 μg/10 μg/50 μg/100 μg | |
| Topo | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
|
M-CSF | Umano | 10 μg/100 μg/500 μg | |
| Topo | 10 μg/100 μg/500 μg | ||
|
GM-CSF | Umano | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| Topo | 10 microgrammi/100 μg/ 500 μg | ||
| IFN-gamma | Umano | 20 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| Topo | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | ||
| IL-4 | Umano | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| Topo | 5 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-10 | Umano | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Topo | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | ||
| IL-13 | Umano | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg | |
| Topo | 2 μg/ 10 μg/ 50 μg/ 100 μg/ 500 μg |
Riferimenti
[1]Atri C, Guerfali FZ, Laouini D.Ruolo della polarizzazione dei macrofagi umani nell'infiammazione durante le malattie infettive. Int J Mol Sci. 2018 19 giugno;19(6):1801.