1.Background della laminina 521
La laminina 521 (LN521) è una proteina chiave di adesione cellulare nella nicchia naturale delle cellule staminali e una matrice per la coltura e l'espansione delle cellule staminali embrionali umane (hES) e pluripotenti indotte (hiPSC). LN521 si lega ai recettori della superficie cellulare e attiva i percorsi di segnalazione cellulare, con conseguente produzione di cellule più funzionali.
Laminina 521 riproduce l'ambiente hPSC biologicamente rilevante in vitro, promuove l'attaccamento, l'elevata sopravvivenza e il forte auto-rinnovamento a lungo termine delle hPSC, ed è una proteina chiave della matrice che supporta la crescita delle cellule staminali e mantiene la stabilità della struttura e delle prestazioni della membrana basale. Laminina 521 è anche una delle matrici di coltura prive di nutrienti più comunemente utilizzate. Inoltre, Laminina 521 può ottenere un efficiente passaggio di cellule singole di cellule staminali geneticamente stabili e pluripotenti senza l'aggiunta di inibitori dell'apoptosi. Le cellule crescono in un monostrato uniforme senza la necessità di rimuovere manualmente aree di differenziazione. Inoltre, studi hanno dimostrato che LN521 può supportare la crescita delle PSC per più di 10 generazioni senza alcun segno di anomalie del cariotipo e mantiene la capacità delle PSC di differenziarsi nei tre strati germinali degli strati germinali interno, intermedio ed esterno.
Figura 1. Struttura della laminina 521 [1]
2.Esperimento di rivestimento di laminina
2.1 Preparare la laminina 521 a 400 µg/ml con acqua deionizzata sterile o acqua per preparazioni iniettabili. Si raccomanda di diluire ulteriormente a 100 µg/ml con 1×DPBS sterile (Ca++/Mg++) prima dell'uso, quindi diluire a una concentrazione di lavoro di 5-10 µg/ml con DPBS sterile (Ca++/Mg++). La concentrazione del rivestimento varia a seconda del tipo di cellule coltivate e si raccomanda di ottimizzare il protocollo sperimentale per determinare la concentrazione di rivestimento ottimale per le cellule. Fare riferimento alla Tabella 1 per le concentrazioni raccomandate.
Nota: DPBS contenente Ca2+ e Mg2+ dovrebbe essere utilizzato, poiché i cationi bivalenti sono importanti per la struttura e la funzione delle proteine. La concentrazione di lavoro richiesta di Laminina 521 dipende dalle cellule e dall'applicazione. Raccomandiamo una concentrazione di rivestimento iniziale di 0,5 μg/cm2.
Tabella 1. Volumi raccomandati di soluzione di lavoro di laminina umana ricombinante per diversi contenitori di coltura.
| Piastra di Petri | Concentrazione del rivestimento (μg/mL) | Quantità aggiuntiva di LN521 | Importo aggiuntivo di 1*DPBS | Volume totale |
| 6 bene | 5 | 50 μL/pozzetto | 950 μL/pozzetto | 1 mL/pozzetto |
| 12 bene | 5 | 25 μL/pozzetto | 475 μL/pozzetto | 0,5 mL/pozzetto |
| 24 bene | 5 | 15 μL/pozzetto | 285 μL/pozzetto | 0,3 mL/pozzetto |
| 48 bene | 5 | 7,5 μL/pozzetto | 142,5 μL/pozzetto | 150 μL/pozzetto |
| 96 bene | 5 | 3,5 μL/pozzetto | 66.5 μL/pozzetto | 70 μL/pozzetto |
| Piastra Petri da 35 mm | 5 | 50 μL/pozzetto | 950 μL/pozzetto | 1 mL/pozzetto |
| Piastra Petri da 60 mm | 5 | 100 μL/pozzetto | 1900 μL/pozzetto | 2 mL/pozzetto |
| Piastra Petri da 100 mm | 5 | 300 μL/pozzetto | 5700 μL/pozzetto | 6 mL/pozzetto |
Il volume sopra indicato si basa su una concentrazione di rivestimento di 5 μg/mL.
2.2 Aggiungere il volume specificato di miscela laminina-DPBS a ogni pozzetto e agitare delicatamente. Assicurarsi che l'intera superficie sia ricoperta di soluzione di rivestimento laminina, poiché le superfici non rivestite non supportano la crescita cellulare.
2.3. Collocare la piastra in un'incubatrice a 37°C e incubare durante la notte. Il tempo minimo di incubazione è di 2 ore, ma si raccomanda l'incubazione durante la notte per ottenere le condizioni ideali per la coltura cellulare. Fare attenzione a non lasciare che il contenitore della coltura si secchi, perché inattiverebbe LN521.
2.4. Quando le cellule sono pronte per essere seminate, aspirare la soluzione di laminina 521.
3.Cultura iPSC
3.1 Scongelamento delle iPSC (prendendo come esempio una piastra da 12 pozzetti)
3.1.1 Rimuovere le iPSC dall'azoto liquido o dal ghiaccio secco e scongelarle in acqua a 37°C per 10 secondi.
3.1.2 Sterilizzare le crioprovette con alcol al 75% e trasferirle su una superficie di lavoro.
3.1.3 Trasferire le cellule in una nuova provetta da centrifuga da 15 mL contenente 9 mL di DMEM‑F12.
3.1.4 Centrifugare la provetta da centrifuga da 15 mL a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente.
3.1.5 Eliminare la soluzione di laminina dalla piastra rivestita da 12 pozzetti.
3.1.6 Eliminare il supernatante cellulare e risospendere delicatamente le iPSC in 1 mL di mTeSR-plus (contenente 10 µM di Y-27632) e trasferirle nella piastra rivestita da 12 pozzetti. Agitare la piastra per distribuire uniformemente le cellule fino a una densità cellulare finale di 1×10^5 cellule/pozzetto e lasciare riposare a temperatura ambiente per 10 minuti. Assicurarsi che la coltura venga sottoposta a passaggio entro 4-5 giorni.
3.1.7 Rimettere la piastra a 12 pozzetti nell'incubatrice a 37°C per l'incubazione.
3.1.8 Il terreno di coltura contenente l'inibitore ROCK deve essere rimosso dopo 12-16 ore e continuare la coltura nel terreno senza inibitore.
Tabella 2. Densità di semina cellulare in diversi contenitori di coltura, numero di cellule determinato in base al tasso di crescita cellulare
| Contenitori per coltura cellulare | 6 bene | 12 bene | 24 bene | 96 bene |
| Numero di cellulare | 2,5~3,5×105 | 6~8×104 | 3~4×104 | Da 0,5 a 1×104 |
3.2. Protocollo di passaggio iPSC
3.2.1 Eliminare il surnatante della coltura e risciacquare con 1 mL di PBS (Ca‑‑/Mg‑‑).
Nota: Utilizzare PBS senza Ca2+ e Mg2+, poiché i cationi bivalenti hanno un effetto negativo su alcuni enzimi di dissociazione.
3.2.2 Eliminare il PBS e aggiungere 0,5 ml di reagente di dissociazione cellulare delicato.Incubare a temperatura ambiente per 6-8 minuti oppure osservare al microscopio fino a quando le cellule non saranno più legate alla piastra.
3.2.3 Aggiungere un volume uguale di DMEM-F12, mescolare delicatamente le cellule, trasferire in una provetta da centrifuga a temperatura ambiente e centrifugare a 300 g per 5 minuti.
3.2.4 Prima di passare le cellule, preparare una piastra da 12 pozzetti rivestita di laminina.
3.2.5 Scartare il surnatante e risospendere le cellule in un mezzo mTeSR‑plus contenente 10 micron Y‑27632.
3.2.6 Trasferire le cellule nella piastra da 12 pozzetti rivestita di laminina preparata. Agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le cellule e lasciare a temperatura ambiente per 10-20 minuti.
3.2.7 Collocare la piastra da 12 pozzetti in un'incubatrice a 37°C e incubare.
Nota: Le iPSC si differenziano rapidamente e muoiono dopo essere cresciute in un monostrato. Per mantenere la crescita e la pluripotenza, devono essere passate prima di essere confluenti.
3.3. Crioconservazione delle iPSC
3.3.1 Preparare il reagente per la dissociazione cellulare delicata.
3.3.2 Eseguire la separazione cellulare secondo il protocollo di passaggio iPSC, utilizzare il conteggio degli organelli cellulari per garantire la densità cellulare prima della crioconservazione.
3.3.3 Ogni provetta di cellule deve essere congelata a una densità cellulare di 1-2×10^6. Seguire i passaggi di centrifugazione e rimozione del terreno di coltura cellulare nel protocollo di passaggio iPSC. Risospendere il pellet iPSC isolato in un volume appropriato di soluzione di crioconservazione
3.3.4 Aggiungere 1 mL di pellet di crioconservazione cellulare risospeso a una provetta di crioconservazione da 1,5 mL, eseguire il raffreddamento del programma e quindi trasferire in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
4.Note importanti sul rivestimento in laminina
4.1. Tutti i passaggi del protocollo sperimentale devono essere eseguiti in condizioni sterili.
4.2. Evitare di esporre la laminina a temperatura ambiente per un lungo periodo di tempo.
4.3. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti
4.4. Dopo lo scongelamento, la soluzione proteica non diluita può essere conservata a 2~8℃ in condizioni sterili e può essere conservata stabilmente per almeno 3 mesi.
5. Informazioni correlate al prodotto
| Nome del prodotto | Gatto# | Misurare |
| Proteina ricombinante umana laminina 521 (senza origine animale) | 92602ES | 10μg/100μg/500μg/1mg |
6.Riferimenti
[1]Pulido D, Briggs DC, Hua J, Hohenester E. L'analisi cristallografica del braccio corto della laminina β2 rivela come il dominio LF viene inserito in una matrice regolare di domini LE. Matrix Biol. 2017 gennaio;57-58:204-212.