Puromicina è un antibiotico aminoglicosidico prodotto da Streptomyces alboniger. È un analogo dell'estremità 3' della molecola di aminoacil-tRNA e può legarsi al sito A del ribosoma, incorporandosi nella catena peptidica in estensione, interrompendo la traslocazione del peptide sul ribosoma, causando la terminazione prematura della catena durante la traduzione e inibendo così la sintesi proteica.
Figura 1 Formula strutturale della Puromicina (CAS N. 53-79-2)
Il gene pac, che codifica la puromicina N-acetiltransferasi (pac), è stato trovato nel batterio produttore di puromicina Streptomyces alboniger, che conferisce resistenza alla puromicina. Questa caratteristica è ora ampiamente utilizzata per lo screening di linee cellulari stabili di mammiferi transfettate che trasportano plasmidi con il gene pac. L'uso diffuso della puromicina nello screening di linee cellulari stabili è correlato alle caratteristiche dei vettori lentivirali, la maggior parte dei quali trasporta il gene pac nei vettori lentivirali commerciali. In alcuni casi specifici, la puromicina può anche essere utilizzata per lo screening di ceppi di E. coli trasformati con plasmidi che trasportano il gene pac. La puromicina agisce rapidamente e può causare rapidamente la morte cellulare a basse concentrazioni. Le cellule di mammifero aderenti sono sensibili a concentrazioni di 2-5 µg/mL di puromicina, mentre le cellule in sospensione sono già sensibili a concentrazioni basse come 0,5-2 µg/mL di puromicina. Le cellule di mammifero con resistenza stabile alla puromicina possono essere generate entro una settimana.
Screening di linee cellulari stabili
Principio sperimentale
Clonando DNA/shRNA esogeno in un vettore che trasporta il gene pac, il vettore ricombinante viene trasfettato nelle cellule ospiti e integrato nei loro cromosomi, trasmesso stabilmente con la divisione cellulare e infine sottoposto a screening con puromicina.
Preparazione e pre-esperimento
1 Concentrazioni d'uso consigliate
Cellule di mammifero: 1-10 μg/mL, la concentrazione ottimale deve essere determinata mediante esperimento preliminare.
E. coli: per lo screening di E. coli trasformati stabili che trasportano il gene pac su terreno agar LB, utilizzare una concentrazione di 125 μg/mL. È richiesta una regolazione precisa del pH per lo screening con puromicina di E. coli trasformati stabili.
2 Metodo di dissoluzione
Sciogliere la puromicina in acqua distillata per preparare una soluzione madre da 50 mg/mL, filtrare, sterilizzare con un filtro da 0,22 μm, aliquotare e conservare a -20°C.
3 Determinazione della curva di uccisione della puromicina (utilizzando la trasfezione shRNA o la trasduzione lentivirale come esempio)
La concentrazione di screening efficace della puromicina è correlata al tipo di cellula, allo stato di crescita, alla densità cellulare, al metabolismo cellulare e alla posizione del ciclo cellulare. È fondamentale determinare la concentrazione minima di puromicina che uccide le cellule non transfettate. È essenziale eseguire un pre-esperimento di screening del gradiente di puromicina per il primo esperimento per stabilire una curva di uccisione.
- Celle a piastre con densità di 5~8×104cellule/pozzetto in una piastra da 24 pozzetti e coltivare durante la notte.
- Preparare il terreno di coltura: terreno fresco contenente diverse concentrazioni di puromicina (ad esempio, 0-15 μg/mL, almeno 5 gradienti).
- Sostituire con un terreno di coltura appena preparato, continuare la coltura e osservare la crescita cellulare, cambiando il terreno di coltura fresco ogni 2-3 giorni.
- Osservare quotidianamente la sopravvivenza delle cellule; la concentrazione minima del farmaco che uccide efficacemente tutte le cellule non transfettate entro 4-6 giorni è la concentrazione minima.
Screening dei transfettanti stabili
- Dopo l'infezione lentivirale per 48-72 ore (70-80% di confluenza), coltivare le cellule in un mezzo contenente una concentrazione appropriata di Puromicina per almeno 48 ore. Quando tutte le cellule nel gruppo di controllo non transfettato con puromicina muoiono, le cellule rimanenti nel gruppo infettato dal virus sono tutte cellule positive.
【Nota】: ① L'effetto degli antibiotici è più pronunciato quando le cellule sono in una fase di divisione attiva. L'efficacia degli antibiotici sarà significativamente ridotta se le cellule sono troppo dense. La densità cellulare non deve superare il 25%. ② Osservare quotidianamente lo stato di crescita cellulare; lo screening con puromicina richiede almeno 48 ore e la concentrazione effettiva dello screening con puromicina dura solitamente da 3 a 10 giorni. Maggiore è il MOI del virus, più copie di shRNA e gene di resistenza alla puromicina contiene ogni cellula. Quando si esegue lo screening con puromicina, maggiore è il MOI, più copie pac contengono le cellule e maggiore è la concentrazione di puromicina che possono tollerare. Regolare la concentrazione di puromicina per esaminare le cellule transfettate, ma la concentrazione di puromicina non deve essere inferiore alla concentrazione minima efficace della curva di uccisione;
- Aggiungere il terreno di coltura contenente la concentrazione minima di puromicina per espandere le cellule e, una volta qualificati i risultati del test qPCR, procedere con la crioconservazione.
| ProdottoS nome | Gatto# | Specificazione | Aspetto |
| Puromicina Dicloridrato CAS:58-58-2 | 60210ES25 | 25mg | Polvere da bianca a biancastra |
| 60210ES60 | 100mg | ||
| 60210ES72 | 250 mg | ||
| 60210ES76 | 500 mg | ||
| 60210ES80 | 1 G | ||
| Puromicina (Soluzione 10 mg/mL) CAS:58-58-2 | 60209ES10 | 1×1 ml | Soluzione (10 mg/mL in H)2O） |
| 60209ES50 | 5×1 ml | ||
| 60209ES60 | 10×1 ml | ||
| 60209ES76 | 50×1 mL |
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