Con il continuo progresso della ricerca medica, la terapia mirata è diventata più matura. La premessa del trattamento mirato è quella di effettuare test genetici sui target molecolari dei farmaci per identificare le mutazioni genetiche che causano disturbi ereditari o neoplasie. ARMS-PCR è un nuovo metodo basato sulla PCR che può rilevare numerose mutazioni puntiformi del DNA. Attualmente, è uno dei metodi più essenziali e diffusi per l'identificazione genetica personalizzata dei tumori. I benefici del suo uso terapeutico sono stati ampiamente riconosciuti dagli esperti del settore.

1. Come funziona la PCR allele-specifica?
2. Come migliorare la specificità dell'ARMS?
3. Quali sono le caratteristiche dei prodotti forniti da Yeasen?
4. Cosa sono i dati sulle prestazioni del prodotto?
5. Come si ordinano i prodotti?

1. Come funziona la PCR allele-specifica?

ARMS-PCR è l'acronimo di Amplification Refractory Mutation System PCR (ARMS-PCR), noto anche come Allele-Specific PCR (AS-PCR). L'estensione allele-specifica è regolata per identificare l'allele di tipo selvatico e il gene di tipo selvatico mutante, e il valore del segnale di fluorescenza è misurato utilizzando la tecnica della sonda Taqman.
I primer PCR ARMS sono progettati con nucleotidi diversi all'estremità 3' dei due primer upstream dell'allele, e i due primer sono, rispettivamente, specifici per il tipo selvatico e per il tipo mutante. Durante l'amplificazione, i primer upstream che non corrispondono completamente allo stampo non sono in grado di formare coppie di basi complementari, con conseguenti disallineamenti, estensione ostacolata e incapacità di generare prodotti PCR, mentre i sistemi primer che corrispondono allo stampo possono amplificare i corrispondenti prodotti PCR. Il fluoroforo sulla sonda Taqman può emettere un segnale fluorescente che può essere rilevato dal dispositivo, e il genotipo può essere convalidato valutando i dati di fluorescenza.
La tecnologia ARMS ha un'elevata sensibilità, il limite di rilevamento può raggiungere 100 copie/mL e il limite di rilevamento per il tessuto tumorale può raggiungere un tasso di mutazione dello 0,5%. Inoltre, ARMS richiede molto tempo ed è poco costosa e i risultati sono intuitivi e facili da giudicare. Questo perché ARMS combinata con la tecnologia qPCR o elettroforesi richiede solo una reazione PCR, che richiede meno tempo. Solo i primer upstream devono essere ottimizzati per la tecnologia ARMS, che ha costi inferiori e risultati intuitivi rispetto alla tecnologia PCR in tempo reale che utilizza sonde MGB. Poiché la maggior parte del DNA estratto da campioni di tessuto inclusi in paraffina è frammentato, non è possibile ottenere risultati di rilevamento accurati. Il metodo ARMS è progettato per ridurre al minimo la lunghezza del prodotto target, affrontando così questa difficoltà nel tessuto incluso in paraffina. Allo stesso tempo, ARMS combinato con la piattaforma PCR realizza un funzionamento in provetta chiusa, che è semplice da utilizzare e non richiede la post-elaborazione del prodotto, evitando così la contaminazione dei prodotti di amplificazione nella massima misura.
Teoricamente, la Taq DNA polimerasi deve essere completamente complementare al modello rimanente all'estremità 3' del primer per eseguire una polimerizzazione efficiente. Tuttavia, la stringenza della Taq DNA è influenzata da diversi fattori. In alcuni casi, un'estensione può procedere anche se la base terminale 3' del primer non è complementare al modello. Se c'è solo una base non corrispondente all'estremità 3', i primer possono essere non corrispondenti ed estesi, ma l'efficienza di estensione è bassa. Diverse dislocazioni all'estremità 3' hanno diverse efficienze di estensione. Se altre basi non corrispondenti vengono introdotte all'estremità 3', il numero di non corrispondenti è troppo grande e l'estremità 3' non può essere estesa dopo un certo livello.Pertanto, una sola discrepanza di basi all'estremità 3' del primer non è sufficiente a distinguere adeguatamente i due alleli, con conseguenti risultati falsi positivi.

2. Come migliorare la specificità dell'ARMS?

L'obiettivo del miglioramento della specificità ARMS è migliorare la specificità dell'estensione dei primer. Una base non corrispondente può essere introdotta alla seconda o terza base dall'estremità 3'. Le basi non corrispondenti agiscono insieme alle basi non corrispondenti all'estremità 3' e, nel modello che non è complementare all'estremità 3', il tasso di prodotto di amplificazione dei primer è ridotto. Mentre i primer si amplificano normalmente nei modelli complementari alle loro estremità 3', il tipo di basi non corrispondenti dei primer dipende dal tipo di base non corrispondente all'estremità 3'.
Dopo aver progettato i primer specifici per ARMS, è richiesta una coppia di sonde TaqMan per il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza allele-specifica. Le sonde TaqMan hanno due coloranti fluorescenti, l'estremità 5' è un gene fluorescente e l'estremità 3' ha un gene di estinzione della fluorescenza generale. In una sonda completa, il gene estinzione e il gene fluorogenico sono spazialmente molto vicini tra loro, con conseguente estinzione della fluorescenza. In circostanze normali, la fluorescenza emessa dal fluoroforo all'estremità 5' non può essere rilevata e può essere rilevata solo la fluorescenza di fondo del quencher all'estremità 3'. Nel processo di amplificazione del gene bersaglio, sia i primer PCR sia le sonde marcate con fluorescenza saranno complementari alla sequenza bersaglio durante il de-OR. Quando l'enzima Taq incontra una sonda stabilmente legata al modello durante l'estensione del filamento modello, l'esonucleasi 5'-3' dell'enzima Taq degraderà la sonda specifica legata al modello. Il fluoroforo sulla sonda è separato dallo spazio fisico, l'effetto di quenching scompare e viene emessa fluorescenza. Le discrepanze tra sonde debolmente fluorescenti e sequenze target ridurranno la quantità di fluorescenza rilasciata.

Figura 1 Concetto fondamentale di ARMS-PCR

3. Quali sono le caratteristiche dei prodotti forniti da Yeasen?

YEASEN Hieff Unicon™ Multiplex ARMS qPCR Mix è un kit basato sul concetto di blocco di amplificazione che consente un'efficiente genotipizzazione mediata da ARMS-PCR.

👍Elevata selettività: in grado di identificare diverse mutazioni genetiche;
👍Elevata sensibilità: i primer mutanti possono rilevare mutazioni a concentrazioni basse fino allo 0,5% in 10 ng/L di DNA;
👍Facile da leggere: i risultati sono evidenti e valutato oggettivamente, e è semplice e diretto;
👍Facile da usare: è compatibile con una vasta gamma di apparecchiature PCR, la modalità di funzionamento è standardizzata e il rilevamento a bordo può essere eseguito in 90 minuti.

4. Cosa sono i dati sulle prestazioni del prodotto?

4.1 Impatto superiore del blocco del prodotto

Esperimento: 5 L di input del modello, 10 ng/L di modello di tipo selvaggio e quantità equivalenti di plasmide mutante sono stati amplificati utilizzando primer mutanti
Sito: KRASG13D (38G>A)
Rosso: 13755; Blu: concorrenti

La Figura 2 dimostra che i primer wild-type amplificano sia i template wild-type che quelli mutanti. Secondo la curva di amplificazione, il template wild-type non ha alcun picco o la differenza nel valore Ct tra wild-type e mutante è 6-8, consentendo di distinguere efficacemente i geni wild-type e mutanti.

4.2 Il tasso di rilevamento del prodotto può raggiungere lo 0,05%

Esperimento 1: Tecnica di preparazione standard con automiscelazione (50%): 50 μL di DNA di tipo selvatico da 10 ng/μL e 50 μL di 3X103 copie di plasmide mutante.
Sito: KRASG13D(38G>A)

Figura 3.Secondo la curva di amplificazione, il prodotto continua a funzionare efficacemente a una concentrazione dello 0,05%

Esperimento 2: Lo standard al 5% acquistato (50 ng/μL) è stato diluito con il diluente della libreria a 10 ng/μL, quindi ulteriormente diluito con 10 ng/μL di DNA 293 g allo 0,1% e allo 0,05%.
Sito: L858R
Rosso: 13755; Blu: concorrenti

Figura 4: In base alla curva di amplificazione, il tasso di rilevamento dei loci rispetto a uno sfondo di gDNA di tipo selvatico di 10 ng/μL può arrivare fino allo 0,05% e la successiva convalida tramite standard commerciali dimostra che i nostri prodotti hanno un tasso di rilevamento eccellente.

4.3 Ottima stabilità del prodotto

Gli effetti di amplificazione e blocco del prodotto non vengono influenzati da 10 cicli di congelamento e scongelamento.
Esperimento: rosso: -20℃; verde: congelamento-scongelamento effettivo 5 volte; blu: congelamento-scongelamento effettivo 8 volte; viola: congelamento-scongelamento effettivo 10 volte.
Sito: L858R

La figura 5 dimostra che il congelamento e lo scongelamento ripetuti del reagente 13755 per dieci volte non hanno alcuna influenza sulle sue proprietà di amplificazione e blocco.

I suoi effetti di amplificazione e blocco non sono influenzati da 37 °C per 7 giorni.
Esperimento: Rosso: -20°C; Verde e viola: 37°C per 7 giorni.
Sito: L858R

La figura 6 dimostra che sette giorni a 37°C non hanno alcuna influenza sull'amplificazione e sull'azione bloccante del reagente 13755.

5. Come si ordinano i prodotti?

Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd., fondata nel 2014, è un'impresa high-tech impegnata nella R&S e nella produzione di materie prime enzimatiche per utensili e anticorpi antigeni. I suoi prodotti includono enzimi diagnostici molecolari, proteine ​​e anticorpi utilizzati in prodotti farmaceutici, test di sicurezza alimentare, allevamento, giustizia e altri settori. Ci impegniamo a fornire ai clienti nel campo delle scienze della vita prodotti e servizi di alta qualità. I ​​prodotti che Yeasen può fornire sono i seguenti:

Tabella 1: Prodotti forniti da Yeasen