Contaminazione da aerosol nell'ambiente operativo come causa più comune di falsi positivi nei risultati della PCR: la scoperta pionieristica dell'uracil DNA glicosilasi (UDG) da parte dello scienziato americano Lindahl in E. coli e Bacillus subtilis e l'istituzione di un sistema di prevenzione della contaminazione da PCR mediante l'uso dell'enzima UDG con dUTP.
Gli enzimi UDG disponibili in commercio sono costituiti principalmente da due tipi: gli enzimi UDG regolari derivati da Escherichia coli e Bacillus subtilis e gli enzimi UDG termolabili derivati da batteri marini psicrofili. Gli enzimi UDG regolari presentano una maggiore resistenza al calore, mantenendo una piccola quantità di attività uracil-DNA glicosilasi anche dopo il trattamento a 95 °C per 10 minuti, il che può portare alla degradazione dei prodotti di amplificazione target contenenti dU. Inoltre, a causa dell'uso di ceppi batterici ingegnerizzati (come E. coli) per l'espressione ricombinante di enzimi molecolari, c'è una certa quantità di DNA genomico ospite residuo in questi enzimi. Insieme alle influenze dell'ambiente di produzione e delle fonti umane, i prodotti enzimatici molecolari sono altamente suscettibili alla contaminazione del DNA. Durante il rilevamento di patogeni, il DNA contaminante può mascherare acidi nucleici target a bassa abbondanza o essere rilevato insieme a essi, influenzando così l'interpretazione dei risultati.
Yeasen UCF.ME Uracile DNA glicosilasi (UDG/UNG), termolabile
Descrizione
La glicosilasi del DNA uracilico UCF.ME (UDG/UNG), termolabile, 1 U/μL (Cat#14466ES) derivato da batteri marini psicrofili, è un enzima UDG termolabile a residuo ultra basso noto come UCF.ME. L'uso di questo prodotto può impedire all'attività residua degli enzimi UDG convenzionali dopo l'inattivazione di degradare i prodotti di amplificazione contenenti dU a temperatura ambiente. Impedisce inoltre ai batteri di fondo presenti negli enzimi molecolari di causare falsi positivi nei risultati PCR. Pertanto, l'introduzione dell'enzima UDG termolabile a residuo ultra basso UCF.ME® è fondamentale per identificare accuratamente i patogeni infettivi e assistere nella diagnosi clinica di infezioni e malattie infettive.
Vantaggi del prodotto
- Residuo ultra-basso di UCF.ME—residuo di DNA genomico di E. coli <0,1 copie/U;
- Basso residuo di nucleasi: nessuna esonucleasi residua, enzima di nicking o RNasi;
- Elevata capacità di digestione: 0,05 U/T possono digerire 105 copie/T di prodotti dU-DNA;
- Buona termolabilità: inattivazione completa in qualsiasi condizione di 50°C per 10 minuti, 55°C per 5 minuti o 95°C per 5 minuti;
- Compatibile con i sistemi di reazione RT-qPCR: nessun impatto sul sistema di rilevamento anche a livelli di input elevati (sistema di reazione 2U/20μL).
（1）Purezza delle proteine ≥95%
Figura 1. Risultati del rilevamento della purezza delle proteine (SDS-PAGE)
（2）Nucleasi a basso residuo: nessuna esonucleasi residua, enzimi di nicking o RNasi
Figura 2. Risultati del test sui residui della nucleasi
（3）Residuo del DNA genomico di E. coli < 0,1 copie/U, i livelli di residuo erano significativamente inferiori rispetto al reagente convenzionale
Figura 3. Risultati del test sui residui del DNA genomico di E. coli
Figura 4. Un totale di 0,05 U di enzima UDG potrebbe digerire completamente 10^5 copie/T di prodotti dU-DNA.
Figura 5. Dopo il trattamento di inattivazione termica a 50℃，10min；55℃，5min；55℃，10min；95℃，5min, 14466ES ha perso la capacità digestiva.
Figura 6. La miscela RT-qPCR è stata preparata utilizzando due sonde di priming dei geni ORF1ab e N e 14466ES. Quando 14466ES è stato iniettato nel sistema di reazione alla quantità di 2U/20μL, non si è verificata alcuna inibizione della RT-qPCR reazione.
Raccomandazione di prodotto — Serie di materie prime enzimatiche per PCR a bassissimo residuo
| Posizionamento del prodotto | Nome del prodotto | Gatto |
| UDG termolabile anticontaminazione | UCF.ME Uracil DNA glicosilasi (UDG/UNG), termolabile, 1 U/μL | 14466ES |
| Taq DNA polimerasi ad avvio caldo | Hieff UCF.ME Taq DNA polimerasi sensibile all'avvio a caldo (5 U/μL) | 14314ES |
| Trascrittasi inversa | Trascrittasi inversa Hifair UCF.ME V (200 U/μL) | 14608ES |
| Inibitore RNasi murino | 14672ES |